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The role of the B1 vacuolar H⁺-ATPase subunit in excretion of acid and bicarbonate along the collecting duct


Kovacikova, Jana. The role of the B1 vacuolar H⁺-ATPase subunit in excretion of acid and bicarbonate along the collecting duct. 2006, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

SUMMARY Terminal portions of the nephron, namely the connecting tubule and the collecting duct, are responsible for fine-tuning of acid-base excretion. This is enabled by at least two types of intercalated cells (IC), type A and B. Acid secretory type A IC expressing vacuolar H+- ATPases on the apical membrane eliminate protons from the body. On the contrary, base secretory type B IC possessing vacuolar H+-ATPases on the basolateral membrane reabsorb protons during metabolic alkalosis. Vacuolar H+-ATPases are composed of several subunits. Among them, the B1 subunit has been shown to be important for normal final urinary acidification in man. The generation of B1 subunit deficient mouse model has enabled the examination of the role of this subunit for normal IC function as well as the interaction of proton transport with other transport processes. In the first series of experiments, we focused on functional interaction between sodium reabsorption and proton secretion in the connecting tubule (CNT) and collecting duct (CD). It has been hypothesised that electrogenic sodium reabsorption via epithelial sodium channels (ENaCs) in the apical membrane of principal cells may promote H+-ATPase-mediated proton secretion by neighbouring ICs by creating a more lumen-negative voltage. Furosemide-induced increases in sodium delivery to the CNT and CCD enhanced urinary acidification and net acid excretion in wild type mice. The effect of furosemide was abolished with amiloride or benzamil, blocking ENaC action. In mice deficient in the kidney-specific vacuolar H+-ATPase B1 subunit, furosemide led to minimal urinary acidification. In contrast, furosemide treatment alone and in combination with hydrochlorothiazide in mice with a kidney-specific inactivation of the α subunit of ENaC in the CCD and MCD, but not in the CNT, led to normal urinary acidification. These results suggest that the B1 subunit of the vacuolar H+-ATPase is necessary for furosemideinduced acute urinary acidification. Loss of ENaC channels in the CCD and MCD did not affect this acidification. Thus, functional expression of ENaC channels in the CNT is sufficient for furosemide-stimulated urinary acidification and identifies the CNT as a major segment in electrogenic urinary acidification. In a second series, we investigated the contribution of the B1 subunit to normal type B IC function. The relative abundance of these cells is increased during metabolic alkalosis since they are specialized in bicarbonate secretion via the apical Cl-/HCO3 - exchanger, pendrin, and proton reabsorption via basolateral vacuolar H+-ATPases. Induction of metabolic alkalosis with deoxycorticosterone acetate (DOCA) and NaHCO3 resulted in a more pronounced alkalosis in B1 deficient mice. The observed alkalosis was associated with increased serum bicarbonate, hypokalemia, and hypochloremia. Furthermore, B1 deficient mice showed decreased total pendrin expression whereas the relative abundance of pendrin expressing cells was increased. H+-ATPase activity in intercalated cells of isolated CCD was strongly reduced, demonstrating that B1 containing H+-ATPases are essential for normal type B intercalated cell function. Furthermore, B1 deficient mice excreted larger quantities of urine which was associated with lower AQP- 2 water channel abundance and a higher relative frequency of principal cells in the connecting tubule. Thus, the B1 subunit of the H+-ATPase is required for normal B-type IC function and its absence may also affect principal cell function. The role of the B1 subunit in bicarbonate secretion and water reabsorption have been hitherto not fully recognized and may also affect renal function in patients with ATP6V1B1 mutations. DEUTSCHE ZUSAMMENFASSUNG DER DOKTORARBEIT Die terminalen Nephronsegmente, d.h. das Verbindungsstück und das Sammelrohr, sind verantwortlich für die Feineinstellung der Säure- Basen-Ausscheidung. Mindestens zwei Typen von Schaltzellen existieren, Typ A und B, die diese Ausscheidung ermöglichen. Säureausscheidende A-Schaltzellen besitzen eine apikale H+-ATPase, durch die die Protonen eliminiert werden. Im Gegensatz zu den A-Schaltzellen besitzen die B-Schaltzellen eine basolaterale H+-ATPase, durch die die Protonen während einer metabolischen Alkalose reabsorbiert werden. Vakuoläre H+-ATPasen bestehen aus mindestens 13 Untereinheiten. Eine von ihnen ist die B1- Untereinheit, die eine entscheidende Rolle für die finale Urinansäuerung im Menschen spielt. Der genetische Knock-out der B1-Untereinheit in Mäusen ermöglichte es, die Rolle dieser Untereinheit für die normale Schaltzellenfunktion und die Interaktion zwischen dem Protonentransport und anderen Transportprozessen zu untersuchen. Die ersten Experimente konzentrierten sich auf die funktionelle Interaktion zwischen der Natriumreabsorption und der Protonenausscheidung im Verbindungsstück und im Sammelrohr. In diesen Nephronsegmenten wird Natrium durch den epithelialen Na+- Kanal (ENaC) in der apikalen Membran der Hauptzellen resorbiert. Da diese Natriumreabsorption elektrogen ist, entsteht ein lumennegatives transzelluläres Potenzial, welches die Protonensekretion durch die H+-ATPase von den benachbarten Schaltzellen antreibt. Die durch das Diuretikum Furosemid erhöhte Natriumabgabe in das Verbindungsstück und in das Sammelrohr fördert die Urinansäuerung und die Netto- Säureausscheidung in normalen Wildtypmäusen. Blockade des ENaC Natriumkanals mit Amilorid und Benzamil hebt diese Wirkung von Furosemid auf. In den Mäusen ohne die B1- Untereinheit der vakuolären H+-ATPase, verursachte Furosemid nur eine minimale Urinansäuerung. In Mäusen mit der nierenspezifisch inaktivierten α-Untereinheit des ENaC im kortikalen und medullären Sammelrohr – jedoch nicht im Verbindungsstück – wurde jedoch nach einer Behandlung mit entweder Furosemid alleine, oder zusammen mit Hydrochlorothiazid, eine normale Urinansäuerung beobachtet. Diese Resultate deuten darauf hin, dass die B1-Untereinheit der vakuolären H+- ATPase für die akute, durch Furosemid induzierte Urinansäuerung notwendig ist. Der Verlust von ENaC-Kanälen im kortikalen und medullären Sammelrohr beeinflusst die Ansäuerung nicht. Die Expression von ENaC-Kanälen im Verbindungsstück ist für die Furosemid-stimulierte Urinansäuerung ausreichend. Das Verbindungsstück wird damit als das Hauptsegment der elektrogenen Urinansäuerung identifiziert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der B1- Untereinheit auf die die normale B-Schaltzellenfunktion untersucht. Da dieser Typ von Schaltzellen auf die Bikarbonatsekretion durch den apikalen Cl- /HCO3 --Austauscher, Pendrin, und die Protonenreabsorption durch die basolaterale H+-ATPase spezialisiert sind, wird ihre relative Häufigkeit während einer metabolischen Alkalose erhöht. Durch Induzierung einer metabolischen Alkalose mit Deoxykortikosteronazetat (DOCA) und NaHCO3, wurde in den B1-defizienten Mäusen eine ausgeprägte Alkalose verursacht, die durch einen erhöhten Serumbikarbonatwert, einer Hypokaliämie und einer Hypochlorämie charakterisiert war. Ausserdem zeigten B1-defiziente Mäuse eine gesamthafte Verminderung der Pendrin-Expression, während die relative Häufigkeit von pendrinexprimierenden Zellen anstieg. Die Aktivität der H+- ATPase in B-Schaltzellen war stark reduziert, was darauf hinweist, dass die H+-ATPasen, die B1-Untereinheit beinhalten, für eine normale Funktion der B-Schaltzellen essentiell sind. B1-defiziente Mäuse schieden zudem grössere Mengen Urin aus, was mit einer niedrigeren Anzahl an AQP2-Kanälen und mit einer höheren relativen Häufigkeit von Hauptzellen im Verbindungsrohr assoziiert war. Demnach ist die B1- Untereinheit der H+-ATPase notwendig für eine normale B-Schaltzellenfunktion, und ihr Fehlen kann auch die Funktion der Hauptzellen beeinträchtigen. Die Rolle der B1- Untereinheit in der Bikarbonatsekretion und in der Wasserreabsorption ist bis jetzt nicht vollständig verstanden und und die Ergebnisse dieser Arbeit können auch zum Verständnis der Pathophysiologie bei Patienten mit einer Mutation in ATP6V1B1 beitragen.

Abstract

SUMMARY Terminal portions of the nephron, namely the connecting tubule and the collecting duct, are responsible for fine-tuning of acid-base excretion. This is enabled by at least two types of intercalated cells (IC), type A and B. Acid secretory type A IC expressing vacuolar H+- ATPases on the apical membrane eliminate protons from the body. On the contrary, base secretory type B IC possessing vacuolar H+-ATPases on the basolateral membrane reabsorb protons during metabolic alkalosis. Vacuolar H+-ATPases are composed of several subunits. Among them, the B1 subunit has been shown to be important for normal final urinary acidification in man. The generation of B1 subunit deficient mouse model has enabled the examination of the role of this subunit for normal IC function as well as the interaction of proton transport with other transport processes. In the first series of experiments, we focused on functional interaction between sodium reabsorption and proton secretion in the connecting tubule (CNT) and collecting duct (CD). It has been hypothesised that electrogenic sodium reabsorption via epithelial sodium channels (ENaCs) in the apical membrane of principal cells may promote H+-ATPase-mediated proton secretion by neighbouring ICs by creating a more lumen-negative voltage. Furosemide-induced increases in sodium delivery to the CNT and CCD enhanced urinary acidification and net acid excretion in wild type mice. The effect of furosemide was abolished with amiloride or benzamil, blocking ENaC action. In mice deficient in the kidney-specific vacuolar H+-ATPase B1 subunit, furosemide led to minimal urinary acidification. In contrast, furosemide treatment alone and in combination with hydrochlorothiazide in mice with a kidney-specific inactivation of the α subunit of ENaC in the CCD and MCD, but not in the CNT, led to normal urinary acidification. These results suggest that the B1 subunit of the vacuolar H+-ATPase is necessary for furosemideinduced acute urinary acidification. Loss of ENaC channels in the CCD and MCD did not affect this acidification. Thus, functional expression of ENaC channels in the CNT is sufficient for furosemide-stimulated urinary acidification and identifies the CNT as a major segment in electrogenic urinary acidification. In a second series, we investigated the contribution of the B1 subunit to normal type B IC function. The relative abundance of these cells is increased during metabolic alkalosis since they are specialized in bicarbonate secretion via the apical Cl-/HCO3 - exchanger, pendrin, and proton reabsorption via basolateral vacuolar H+-ATPases. Induction of metabolic alkalosis with deoxycorticosterone acetate (DOCA) and NaHCO3 resulted in a more pronounced alkalosis in B1 deficient mice. The observed alkalosis was associated with increased serum bicarbonate, hypokalemia, and hypochloremia. Furthermore, B1 deficient mice showed decreased total pendrin expression whereas the relative abundance of pendrin expressing cells was increased. H+-ATPase activity in intercalated cells of isolated CCD was strongly reduced, demonstrating that B1 containing H+-ATPases are essential for normal type B intercalated cell function. Furthermore, B1 deficient mice excreted larger quantities of urine which was associated with lower AQP- 2 water channel abundance and a higher relative frequency of principal cells in the connecting tubule. Thus, the B1 subunit of the H+-ATPase is required for normal B-type IC function and its absence may also affect principal cell function. The role of the B1 subunit in bicarbonate secretion and water reabsorption have been hitherto not fully recognized and may also affect renal function in patients with ATP6V1B1 mutations. DEUTSCHE ZUSAMMENFASSUNG DER DOKTORARBEIT Die terminalen Nephronsegmente, d.h. das Verbindungsstück und das Sammelrohr, sind verantwortlich für die Feineinstellung der Säure- Basen-Ausscheidung. Mindestens zwei Typen von Schaltzellen existieren, Typ A und B, die diese Ausscheidung ermöglichen. Säureausscheidende A-Schaltzellen besitzen eine apikale H+-ATPase, durch die die Protonen eliminiert werden. Im Gegensatz zu den A-Schaltzellen besitzen die B-Schaltzellen eine basolaterale H+-ATPase, durch die die Protonen während einer metabolischen Alkalose reabsorbiert werden. Vakuoläre H+-ATPasen bestehen aus mindestens 13 Untereinheiten. Eine von ihnen ist die B1- Untereinheit, die eine entscheidende Rolle für die finale Urinansäuerung im Menschen spielt. Der genetische Knock-out der B1-Untereinheit in Mäusen ermöglichte es, die Rolle dieser Untereinheit für die normale Schaltzellenfunktion und die Interaktion zwischen dem Protonentransport und anderen Transportprozessen zu untersuchen. Die ersten Experimente konzentrierten sich auf die funktionelle Interaktion zwischen der Natriumreabsorption und der Protonenausscheidung im Verbindungsstück und im Sammelrohr. In diesen Nephronsegmenten wird Natrium durch den epithelialen Na+- Kanal (ENaC) in der apikalen Membran der Hauptzellen resorbiert. Da diese Natriumreabsorption elektrogen ist, entsteht ein lumennegatives transzelluläres Potenzial, welches die Protonensekretion durch die H+-ATPase von den benachbarten Schaltzellen antreibt. Die durch das Diuretikum Furosemid erhöhte Natriumabgabe in das Verbindungsstück und in das Sammelrohr fördert die Urinansäuerung und die Netto- Säureausscheidung in normalen Wildtypmäusen. Blockade des ENaC Natriumkanals mit Amilorid und Benzamil hebt diese Wirkung von Furosemid auf. In den Mäusen ohne die B1- Untereinheit der vakuolären H+-ATPase, verursachte Furosemid nur eine minimale Urinansäuerung. In Mäusen mit der nierenspezifisch inaktivierten α-Untereinheit des ENaC im kortikalen und medullären Sammelrohr – jedoch nicht im Verbindungsstück – wurde jedoch nach einer Behandlung mit entweder Furosemid alleine, oder zusammen mit Hydrochlorothiazid, eine normale Urinansäuerung beobachtet. Diese Resultate deuten darauf hin, dass die B1-Untereinheit der vakuolären H+- ATPase für die akute, durch Furosemid induzierte Urinansäuerung notwendig ist. Der Verlust von ENaC-Kanälen im kortikalen und medullären Sammelrohr beeinflusst die Ansäuerung nicht. Die Expression von ENaC-Kanälen im Verbindungsstück ist für die Furosemid-stimulierte Urinansäuerung ausreichend. Das Verbindungsstück wird damit als das Hauptsegment der elektrogenen Urinansäuerung identifiziert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der B1- Untereinheit auf die die normale B-Schaltzellenfunktion untersucht. Da dieser Typ von Schaltzellen auf die Bikarbonatsekretion durch den apikalen Cl- /HCO3 --Austauscher, Pendrin, und die Protonenreabsorption durch die basolaterale H+-ATPase spezialisiert sind, wird ihre relative Häufigkeit während einer metabolischen Alkalose erhöht. Durch Induzierung einer metabolischen Alkalose mit Deoxykortikosteronazetat (DOCA) und NaHCO3, wurde in den B1-defizienten Mäusen eine ausgeprägte Alkalose verursacht, die durch einen erhöhten Serumbikarbonatwert, einer Hypokaliämie und einer Hypochlorämie charakterisiert war. Ausserdem zeigten B1-defiziente Mäuse eine gesamthafte Verminderung der Pendrin-Expression, während die relative Häufigkeit von pendrinexprimierenden Zellen anstieg. Die Aktivität der H+- ATPase in B-Schaltzellen war stark reduziert, was darauf hinweist, dass die H+-ATPasen, die B1-Untereinheit beinhalten, für eine normale Funktion der B-Schaltzellen essentiell sind. B1-defiziente Mäuse schieden zudem grössere Mengen Urin aus, was mit einer niedrigeren Anzahl an AQP2-Kanälen und mit einer höheren relativen Häufigkeit von Hauptzellen im Verbindungsrohr assoziiert war. Demnach ist die B1- Untereinheit der H+-ATPase notwendig für eine normale B-Schaltzellenfunktion, und ihr Fehlen kann auch die Funktion der Hauptzellen beeinträchtigen. Die Rolle der B1- Untereinheit in der Bikarbonatsekretion und in der Wasserreabsorption ist bis jetzt nicht vollständig verstanden und und die Ergebnisse dieser Arbeit können auch zum Verständnis der Pathophysiologie bei Patienten mit einer Mutation in ATP6V1B1 beitragen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Wagner Carsten Alexander, Murer Heini
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2006
Deposited On:23 May 2019 11:29
Last Modified:25 Sep 2019 00:16
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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