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Function of latent membrane protein 2B in EBV-positive Burkitt's lymphoma


Rechsteiner, Markus. Function of latent membrane protein 2B in EBV-positive Burkitt's lymphoma. 2008, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a human γ-herpesvirus that, following primary infection, persists latently in the host’s memory B-cell pool for life and may periodically reactivate to lytic infection. EBV is linked to malignancies including Burkitt’s lymphoma (BL), Hodgkin’s lymphoma (HL), and post-transplant lymphoproliferative diseases where it expresses different patterns of latency genes. Among these genes, latent membrane protein (LMP)2A and LMP2B seem to be involved in the regulation of EBV latency. LMP2A blocks the signalling from the B-cell receptor (BCR) after its engagement, which results otherwise in switching from latent to lytic EBV infection and induction of apoptosis. Therefore, LMP2A contributes to ensuring the persistence of EBV in the latently infected B-cell. By contrast, the function of LMP2B, a splice variant of LMP2A, and its interaction with LMP2A is still not resolved. Thus, the investigation of the function of LMP2B and its contribution to latent and lytic EBV infection was the main goal of my PhD thesis. To study switching of latent to lytic EBV the EBV-harboring BL cell line Akata was employed. BL Akata cells can easily be induced to switch latent to lytic EBV upon engagement of their BCR through cross-linking using anti-human immunoglobulin antibodies. BL Akata cells with silenced LMP2A, silenced LMP2B, overexpressed LMP2A, or overexpressed LMP2B were generated. The establishment of these cell lines revealed for the first time that silencing of LMP2B in EBV-harboring BL cells resulted in reduced expression of the initiator of lytic EBV, i.e., immediate-early lytic BZLF1 EBV gene mRNA and late lytic gp350/220 protein upon BCR cross-linking. Similarly, reduction of lytic EBV activation was observed in BL Akata cells overexpressing LMP2A. By contrast, silencing of LMP2A and LMP2B overexpression in BL Akata cells resulted in higher lytic EBV mRNA and protein expression upon BCR cross- linking. We could further demonstrate that LMP2A and LMP2B physically interact and that LMP2B resides predominantly in intracellular compartments, whereas LMP2A was detected on the plasma membrane as well as in intracellular compartments. In conclusion, these observations indicate a role for LMP2B distinct from LMP2A in regulation of lytic EBV activation in the host cell and support the hypothesis that LMP2B exhibits a negative regulatory effect on the ability of LMP2A to maintain latent EBV by preventing the switch to lytic EBV.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist ein humanes γ-Herpesvirus, welches nach der Primärinfektion eine lebenslange, latente Infektion in memory B Zellen etabliert und periodisch in seine lytische Form wechseln kann. EBV wird mit verschiedenen Malignomen assoziiert, unter anderem mit dem Burkitt’s Lymphom (BL), dem Hodgkin’s Lymphom (HL) und der lymphoproliferativen Krankheiten nach Organtransplantation, in denen das Virus unterschiedliche Expressionsmuster der Latenzgene aufweist. Unter diesen Genen befindet sich das Latente Membran Protein (LMP)2A und LMP2B, welche die lytische und latente Form von EBV zu regulieren scheinen. LMP2A blockiert die Signalkaskade welche vom B Zell Rezeptor nach dessen Aktivierung durch ein fremdes Antigen ausgelöst wird. Die Signalkaskade würde im Normalfall zur Induktion der lytischen Form von EBV führen und letztendlich in Apoptose enden. Deshalb stellt LMP2A die Aufrechterhaltung des latenten Zustandes von EBV sicher. Andererseits ist über die Funktion von LMP2B, einer Splicevariante von LMP2A, wenig bekannt. Das Hauptziel meines PhD Projektes war nun, die Funktion von LMP2B zu definieren und seinen Beitrag zur latenten und lytischen EBV Infektion zu untersuchen. Um die Aktivierung von latentem zu lytischem EBV zu studieren, wurde die EBV-positive BL Zelllinie Akata verwendet. BL Akata Zellen können leicht stimuliert werden, indem der B Zell Rezeptor mit spezifischen menschlichen Immunglobulinen aktiviert wird, was zur Induktion von lytischem EBV führt. Deshalb wurden BL Akata Zellen mit gesilenztem LMP2A, gesilenztem LMP2B, überexprimiertem LMP2A und überexprimiertem LMP2B etabliert. Diese Zelllinien ermöglichten zum ersten Mal zu demonstrieren, dass durch gesilenztes LMP2B die lytische Aktivierung von EBV vermindert werden konnte. Als read-out bestimmten wir die mRNA Expression des initialen lytischen EBV Genes BZLF1 und die Proteinmenge des viralen Hüllenproteins gp350/220 nach B Zell Rezeptor Stimulation. Vergleichsweise führte die Überexpression von LMP2A zu verminderter lytischen EBV Aktivierung in BL Akata Zellen. Anderseits resultierte das Silenzing von LMP2A und die Überexpression von LMP2B in BL Akata Zellen nach Stimulation in höheren lytischen EBV mRNA- und Proteinlevels. Des Weiteren wurde gezeigt, dass LMP2A und LMP2B physikalisch interagieren und dass LMP2B hauptsächlich in intrazellulären Kompartimenten vorkommt, während LMP2A auf der Plasmamembran sowie in intrazellulären Kompartimenten detektiert wurde. Diese Beobachtungen lassen auf eine unterschiedliche Rolle von LMP2B in der Regulation von lytischem und latentem EBV im Vergleich zu LMP2A schliessen und unterstützt die Hypothese, dass LMP2B einen negativ regulatorischen Effekt auf LMP2A und dessen Funktion in der Aufrechterhaltung des latenten Zustandes von EBV aufweist.

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a human γ-herpesvirus that, following primary infection, persists latently in the host’s memory B-cell pool for life and may periodically reactivate to lytic infection. EBV is linked to malignancies including Burkitt’s lymphoma (BL), Hodgkin’s lymphoma (HL), and post-transplant lymphoproliferative diseases where it expresses different patterns of latency genes. Among these genes, latent membrane protein (LMP)2A and LMP2B seem to be involved in the regulation of EBV latency. LMP2A blocks the signalling from the B-cell receptor (BCR) after its engagement, which results otherwise in switching from latent to lytic EBV infection and induction of apoptosis. Therefore, LMP2A contributes to ensuring the persistence of EBV in the latently infected B-cell. By contrast, the function of LMP2B, a splice variant of LMP2A, and its interaction with LMP2A is still not resolved. Thus, the investigation of the function of LMP2B and its contribution to latent and lytic EBV infection was the main goal of my PhD thesis. To study switching of latent to lytic EBV the EBV-harboring BL cell line Akata was employed. BL Akata cells can easily be induced to switch latent to lytic EBV upon engagement of their BCR through cross-linking using anti-human immunoglobulin antibodies. BL Akata cells with silenced LMP2A, silenced LMP2B, overexpressed LMP2A, or overexpressed LMP2B were generated. The establishment of these cell lines revealed for the first time that silencing of LMP2B in EBV-harboring BL cells resulted in reduced expression of the initiator of lytic EBV, i.e., immediate-early lytic BZLF1 EBV gene mRNA and late lytic gp350/220 protein upon BCR cross-linking. Similarly, reduction of lytic EBV activation was observed in BL Akata cells overexpressing LMP2A. By contrast, silencing of LMP2A and LMP2B overexpression in BL Akata cells resulted in higher lytic EBV mRNA and protein expression upon BCR cross- linking. We could further demonstrate that LMP2A and LMP2B physically interact and that LMP2B resides predominantly in intracellular compartments, whereas LMP2A was detected on the plasma membrane as well as in intracellular compartments. In conclusion, these observations indicate a role for LMP2B distinct from LMP2A in regulation of lytic EBV activation in the host cell and support the hypothesis that LMP2B exhibits a negative regulatory effect on the ability of LMP2A to maintain latent EBV by preventing the switch to lytic EBV.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist ein humanes γ-Herpesvirus, welches nach der Primärinfektion eine lebenslange, latente Infektion in memory B Zellen etabliert und periodisch in seine lytische Form wechseln kann. EBV wird mit verschiedenen Malignomen assoziiert, unter anderem mit dem Burkitt’s Lymphom (BL), dem Hodgkin’s Lymphom (HL) und der lymphoproliferativen Krankheiten nach Organtransplantation, in denen das Virus unterschiedliche Expressionsmuster der Latenzgene aufweist. Unter diesen Genen befindet sich das Latente Membran Protein (LMP)2A und LMP2B, welche die lytische und latente Form von EBV zu regulieren scheinen. LMP2A blockiert die Signalkaskade welche vom B Zell Rezeptor nach dessen Aktivierung durch ein fremdes Antigen ausgelöst wird. Die Signalkaskade würde im Normalfall zur Induktion der lytischen Form von EBV führen und letztendlich in Apoptose enden. Deshalb stellt LMP2A die Aufrechterhaltung des latenten Zustandes von EBV sicher. Andererseits ist über die Funktion von LMP2B, einer Splicevariante von LMP2A, wenig bekannt. Das Hauptziel meines PhD Projektes war nun, die Funktion von LMP2B zu definieren und seinen Beitrag zur latenten und lytischen EBV Infektion zu untersuchen. Um die Aktivierung von latentem zu lytischem EBV zu studieren, wurde die EBV-positive BL Zelllinie Akata verwendet. BL Akata Zellen können leicht stimuliert werden, indem der B Zell Rezeptor mit spezifischen menschlichen Immunglobulinen aktiviert wird, was zur Induktion von lytischem EBV führt. Deshalb wurden BL Akata Zellen mit gesilenztem LMP2A, gesilenztem LMP2B, überexprimiertem LMP2A und überexprimiertem LMP2B etabliert. Diese Zelllinien ermöglichten zum ersten Mal zu demonstrieren, dass durch gesilenztes LMP2B die lytische Aktivierung von EBV vermindert werden konnte. Als read-out bestimmten wir die mRNA Expression des initialen lytischen EBV Genes BZLF1 und die Proteinmenge des viralen Hüllenproteins gp350/220 nach B Zell Rezeptor Stimulation. Vergleichsweise führte die Überexpression von LMP2A zu verminderter lytischen EBV Aktivierung in BL Akata Zellen. Anderseits resultierte das Silenzing von LMP2A und die Überexpression von LMP2B in BL Akata Zellen nach Stimulation in höheren lytischen EBV mRNA- und Proteinlevels. Des Weiteren wurde gezeigt, dass LMP2A und LMP2B physikalisch interagieren und dass LMP2B hauptsächlich in intrazellulären Kompartimenten vorkommt, während LMP2A auf der Plasmamembran sowie in intrazellulären Kompartimenten detektiert wurde. Diese Beobachtungen lassen auf eine unterschiedliche Rolle von LMP2B in der Regulation von lytischem und latentem EBV im Vergleich zu LMP2A schliessen und unterstützt die Hypothese, dass LMP2B einen negativ regulatorischen Effekt auf LMP2A und dessen Funktion in der Aufrechterhaltung des latenten Zustandes von EBV aufweist.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Jiricny Josef, Nadal David, Greber U
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > University Children's Hospital Zurich > Medical Clinic
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2008
Deposited On:03 Mar 2009 12:46
Last Modified:24 Sep 2019 16:02
Number of Pages:79
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005722460&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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