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Functional and structural analysis of the activation mechanism of Caspase-8


Keller, Nadine. Functional and structural analysis of the activation mechanism of Caspase-8. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Human caspase-8 is an enzyme involved in apoptosis, a process essential to remove unwanted or diseased cells throughout the life of multicellular or- ganisms. Initially caspase-8 is produced in the cell as the monomeric latent precursor procaspase-8 comprising an N-terminal prodomain with two death effector domains followed by a catalytic domain that contains two subunits connected by a 40 amino acid linker. The catalytic domain harbors the sub- strate binding pocket and the active site residue cysteine. Activation of the enzyme occurs upon binding of the zymogen to the macromolecular death inducing signaling complex, DISC. This binding is facilitated by homotypic death effector domain interactions between the prodomain of procaspase-8 and the adapter protein FADD. Bound to the DISC procaspase-8 becomes activated by dimerization and subsequent proteolytic processing. This thesis analyzes the activation mechanism of caspase-8 in more detail using biochemical and biophysical as well as structural methods. Thereby, chapter 2 focuses on the prodomain and its binding to FADD whereas chap- ters 3 and 4 analyze the structural changes occurring within the catalytic domain of caspase-8. The determinants for binding of procaspase-8 prodomain to FADD were analyzed using pull-down experiments. It was shown that FADD binding depends on the complete prodomain since individual death effector domains were not able to bind FADD. During purification and pull-down experiments an additional oligomerization of the prodomains was evident. An initial hypothesis stated that this oligomerization is cysteine dependent. How- ever, mutation of two cysteins in the second death effector domain of the prodomain of caspase-8 could not confirm this, neither with pull-down ex-

iii iv ABSTRACT

periments nor in cell biological assays. Preliminary studies using fusion tagged caspase-8 prodomain and FADD were conducted to form a complex between FADD and the caspase-8 pro- domain for biochemical and structural studies. However, current problems include a high aggregation tendency of the proteins and the presence of large fusion tags, which might hamper structure determination. Therefore, a discussion in chapter 2.3 includes several strategies to circumvent these problems in future experiments. Whereas structure determination of the prodomain proved to be difficult the structure of the catalytic domain of the caspase-8 zymogen, procaspase-8 was determined by solution NMR. Whereas the secondary structure elements of procaspase-8 resemble the ones of active caspase-8 significant differences were observed in the loops surrounding the substrate binding pocket and the linker connecting the two subunits. Biochemical and biophysical analyses on a set of various dimerization and processing mutants were performed to elucidate the transition from monomeric procaspase-8 to active dimeric caspase-8 and the influence of inhibitor binding. These studies clearly confirm the require- ment of dimerization for caspase-8 activity in unprocessed but also processed form by inducing structural changes around the active site. In addition, it was shown that dimerization is important for activation of the enzyme by relocating the intersubunit linker, which in procaspase-8 covers part of the substrate binding region, into close proximity of the active site of the as- sociated protomer thus allowing intermolecular cleavage within the dimer. Processing has to occur at both cleavage sites within the linker to achieve full caspase-8 activity. After processing structural rearrangements in the ac- tive site forming loops and the cleaved linker fragments occur resulting in a preformed active site. Upon substrate binding this region then undergoes additional changes to accommodate the substrate. This work clearly confirms the importance of dimerization for activation and activity of caspase-8. Furthermore, it highlights the additional importance of proteolytic processing for the activation process. Thus the here described data allow a refinement of the previous model for caspase-8 activation and most likely provides insights into the activation mechanism of other caspases. Das Enzym Caspase-8 spielt eine ausschlaggebende Rolle in der Apoptose, einem Prozess welcher für die Eliminierung von kranken oder überschüss- sigen Zellen in mehrzelligen Organismen verantwortlich ist. In der Zelle wird Caspase-8 zunächst als inaktives Zymogen, sogenannte Procaspase- 8, produziert. In dieser Form besteht das Enzym aus einer N-terminalen Prodomäne mit zwei Todeseffektordomänen und einer C-terminalen kat- alytischen Domäne, welche in zwei Untereinheiten unterteilt ist und die Sub- stratbingungsstelle und das katalytische Cystein enthält. Die Aktivierung von Caspase-8 erfolgt durch Bindung der Prodomäne an das Adapterprotein FADD welches Teil eines hochmolekularen Komplexes genannt DISC (death inducing signaling complex) ist. Dort wird durch Dimerisierung und prote- olytische Spaltung das aktive Enzym gebildet. Diese Doktorarbeit beschreibt biochemische, biophysikalische und strukturelle Experimente zur Untersuchung des detailierten Aktivierungsmechanismus der Caspase-8. Im Wesentlichen enthält diese Arbeit zwei Hauptteile: Im Kapitel 2 wird die Interaktion zwischen der Prodomäne und FADD genauer analysiert, während in den Kapiteln 3 und 4 die strukturellen Änderungen in der katalytischen Domäne während des Aktiverungsprozesses genauer un- tersucht werden. Die Bindung zwischen der Prodomäne der Caspase-8 und FADD wurde durch biochemische Interaktionsstudien analysiert. Darin wurde gezeigt, dass beide Todeseffektordomänen der Prodomäne benötig werden um FADD zu binden, da keine Bindung durch individuelle Todeseffektordomänen er- folgte. Während der Proteinreinigung und der Interaktionsstudien wurde wiederholt eine Oligomerisation der Prodomäne beobachtet, welche ursprüng-

v vi ZUSAMMENFASSUNG

lich auf die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den Prodomänen zurück- geführt wurde. Mutation von zwei Cysteinen in der zweiten Todeseffektor- domäne zeigte allerdings, dass dieses Phenomän nicht cysteinabhängig und höchstwahrscheinlich biologisch nicht relevant ist. Erste Versuche zur Expression und Reinigung eines Komplexes bestehend aus Prodomäne und FADD für biochemische und strukturelle Charakterisierun- gen wurden durchgeführt. Allerdings wurden diese Experimente durch eine hohe Tendenz der Prodomäne zur Aggregation und das Vorhandensein von grossen Fusionsdomänen an der Prodomäne und am FADD erschwert. Eine ausführliche Diskussion im Kapitel 2.3 beschreibt verschiedene Strategien, diese Probleme in zukünftigen Experimenten zu bewältigen. Während die Strukturbestimmung der Prodomäne bis jetzt nicht erfolgreich war, wurde die Struktur der katalytischen Domäne der inaktiven Procaspase- 8 mittels Kernresonanzspektroskopie bestimmt. Diese Struktur zeigt, dass die Sekundärstrukturelemente der Procaspase-8 im Vergleich zur Caspase-8 konserviert sind. Unterschiede zwischen den beiden Strukturen sind in den Loops um die Substratbindungsstelle und dem Linker zwischen den Unterein- heiten der katalytischen Domäne zu finden. Biochemische und biophysikalis- che Analysen an verschiedenen Dimerisierungs- und Prozessierungsmutan- ten erlauben Einblicke in den strukturellen Übergang von der Procaspase-8 zur Caspase-8 und die Substatbindung an das Enzym. Diese Experimente deuten darauf hin, dass Dimerisierung eine Umlagerung des Linkers her- beiführt. In monomerer Procaspase-8 bedeckt ein Teil des Linkers die Stelle, an welcher die Substratbindungstasche in der aktiven Caspase-8 gebildet wird. Durch die Dimerisierung wird die Position des Linkers so umgelagert, dass dessen Prozessierungsstellen in die Nähe des katalytischen Cysteins des zweiten Caspase-8 Moleküles vom gleichen Dimer rücken und somit inter- molekulare Spaltung innerhalb des Dimers ermöglicht wird. Dabei ist es wichtig, dass die Caspase-8 an beiden Prozessierungsstellen gespalten wird, um die volle Aktivität des Enzyms zu erhalten. Nach der Spaltung erfolgen strukturelle Änderungen in den Loops an der Substratbindungsstelle und den gespaltenen Linkerfragmenten. Dadurch wird die Substratbindungstasche teilweise ausgebildet. Weitere Umlagerungen zur vollständigen Bildung der Bindungstasche erfolgen während der Substratbindung. vii

Diese Arbeit bestätigt den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivierung und Aktivität der Caspase-8. Zusätzlich wird deutlich gemacht, dass pro- teolytische Spaltung eine massgebliche Rolle im Aktivierungsprozess spielt. Die präsentierten Ergebnisse erlauben ein tieferes Verständniss des derzeiti- gen Aktivierungsmechanismusses der Caspase-8 und möglicherweise anderer Caspasen.

Abstract

Human caspase-8 is an enzyme involved in apoptosis, a process essential to remove unwanted or diseased cells throughout the life of multicellular or- ganisms. Initially caspase-8 is produced in the cell as the monomeric latent precursor procaspase-8 comprising an N-terminal prodomain with two death effector domains followed by a catalytic domain that contains two subunits connected by a 40 amino acid linker. The catalytic domain harbors the sub- strate binding pocket and the active site residue cysteine. Activation of the enzyme occurs upon binding of the zymogen to the macromolecular death inducing signaling complex, DISC. This binding is facilitated by homotypic death effector domain interactions between the prodomain of procaspase-8 and the adapter protein FADD. Bound to the DISC procaspase-8 becomes activated by dimerization and subsequent proteolytic processing. This thesis analyzes the activation mechanism of caspase-8 in more detail using biochemical and biophysical as well as structural methods. Thereby, chapter 2 focuses on the prodomain and its binding to FADD whereas chap- ters 3 and 4 analyze the structural changes occurring within the catalytic domain of caspase-8. The determinants for binding of procaspase-8 prodomain to FADD were analyzed using pull-down experiments. It was shown that FADD binding depends on the complete prodomain since individual death effector domains were not able to bind FADD. During purification and pull-down experiments an additional oligomerization of the prodomains was evident. An initial hypothesis stated that this oligomerization is cysteine dependent. How- ever, mutation of two cysteins in the second death effector domain of the prodomain of caspase-8 could not confirm this, neither with pull-down ex-

iii iv ABSTRACT

periments nor in cell biological assays. Preliminary studies using fusion tagged caspase-8 prodomain and FADD were conducted to form a complex between FADD and the caspase-8 pro- domain for biochemical and structural studies. However, current problems include a high aggregation tendency of the proteins and the presence of large fusion tags, which might hamper structure determination. Therefore, a discussion in chapter 2.3 includes several strategies to circumvent these problems in future experiments. Whereas structure determination of the prodomain proved to be difficult the structure of the catalytic domain of the caspase-8 zymogen, procaspase-8 was determined by solution NMR. Whereas the secondary structure elements of procaspase-8 resemble the ones of active caspase-8 significant differences were observed in the loops surrounding the substrate binding pocket and the linker connecting the two subunits. Biochemical and biophysical analyses on a set of various dimerization and processing mutants were performed to elucidate the transition from monomeric procaspase-8 to active dimeric caspase-8 and the influence of inhibitor binding. These studies clearly confirm the require- ment of dimerization for caspase-8 activity in unprocessed but also processed form by inducing structural changes around the active site. In addition, it was shown that dimerization is important for activation of the enzyme by relocating the intersubunit linker, which in procaspase-8 covers part of the substrate binding region, into close proximity of the active site of the as- sociated protomer thus allowing intermolecular cleavage within the dimer. Processing has to occur at both cleavage sites within the linker to achieve full caspase-8 activity. After processing structural rearrangements in the ac- tive site forming loops and the cleaved linker fragments occur resulting in a preformed active site. Upon substrate binding this region then undergoes additional changes to accommodate the substrate. This work clearly confirms the importance of dimerization for activation and activity of caspase-8. Furthermore, it highlights the additional importance of proteolytic processing for the activation process. Thus the here described data allow a refinement of the previous model for caspase-8 activation and most likely provides insights into the activation mechanism of other caspases. Das Enzym Caspase-8 spielt eine ausschlaggebende Rolle in der Apoptose, einem Prozess welcher für die Eliminierung von kranken oder überschüss- sigen Zellen in mehrzelligen Organismen verantwortlich ist. In der Zelle wird Caspase-8 zunächst als inaktives Zymogen, sogenannte Procaspase- 8, produziert. In dieser Form besteht das Enzym aus einer N-terminalen Prodomäne mit zwei Todeseffektordomänen und einer C-terminalen kat- alytischen Domäne, welche in zwei Untereinheiten unterteilt ist und die Sub- stratbingungsstelle und das katalytische Cystein enthält. Die Aktivierung von Caspase-8 erfolgt durch Bindung der Prodomäne an das Adapterprotein FADD welches Teil eines hochmolekularen Komplexes genannt DISC (death inducing signaling complex) ist. Dort wird durch Dimerisierung und prote- olytische Spaltung das aktive Enzym gebildet. Diese Doktorarbeit beschreibt biochemische, biophysikalische und strukturelle Experimente zur Untersuchung des detailierten Aktivierungsmechanismus der Caspase-8. Im Wesentlichen enthält diese Arbeit zwei Hauptteile: Im Kapitel 2 wird die Interaktion zwischen der Prodomäne und FADD genauer analysiert, während in den Kapiteln 3 und 4 die strukturellen Änderungen in der katalytischen Domäne während des Aktiverungsprozesses genauer un- tersucht werden. Die Bindung zwischen der Prodomäne der Caspase-8 und FADD wurde durch biochemische Interaktionsstudien analysiert. Darin wurde gezeigt, dass beide Todeseffektordomänen der Prodomäne benötig werden um FADD zu binden, da keine Bindung durch individuelle Todeseffektordomänen er- folgte. Während der Proteinreinigung und der Interaktionsstudien wurde wiederholt eine Oligomerisation der Prodomäne beobachtet, welche ursprüng-

v vi ZUSAMMENFASSUNG

lich auf die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den Prodomänen zurück- geführt wurde. Mutation von zwei Cysteinen in der zweiten Todeseffektor- domäne zeigte allerdings, dass dieses Phenomän nicht cysteinabhängig und höchstwahrscheinlich biologisch nicht relevant ist. Erste Versuche zur Expression und Reinigung eines Komplexes bestehend aus Prodomäne und FADD für biochemische und strukturelle Charakterisierun- gen wurden durchgeführt. Allerdings wurden diese Experimente durch eine hohe Tendenz der Prodomäne zur Aggregation und das Vorhandensein von grossen Fusionsdomänen an der Prodomäne und am FADD erschwert. Eine ausführliche Diskussion im Kapitel 2.3 beschreibt verschiedene Strategien, diese Probleme in zukünftigen Experimenten zu bewältigen. Während die Strukturbestimmung der Prodomäne bis jetzt nicht erfolgreich war, wurde die Struktur der katalytischen Domäne der inaktiven Procaspase- 8 mittels Kernresonanzspektroskopie bestimmt. Diese Struktur zeigt, dass die Sekundärstrukturelemente der Procaspase-8 im Vergleich zur Caspase-8 konserviert sind. Unterschiede zwischen den beiden Strukturen sind in den Loops um die Substratbindungsstelle und dem Linker zwischen den Unterein- heiten der katalytischen Domäne zu finden. Biochemische und biophysikalis- che Analysen an verschiedenen Dimerisierungs- und Prozessierungsmutan- ten erlauben Einblicke in den strukturellen Übergang von der Procaspase-8 zur Caspase-8 und die Substatbindung an das Enzym. Diese Experimente deuten darauf hin, dass Dimerisierung eine Umlagerung des Linkers her- beiführt. In monomerer Procaspase-8 bedeckt ein Teil des Linkers die Stelle, an welcher die Substratbindungstasche in der aktiven Caspase-8 gebildet wird. Durch die Dimerisierung wird die Position des Linkers so umgelagert, dass dessen Prozessierungsstellen in die Nähe des katalytischen Cysteins des zweiten Caspase-8 Moleküles vom gleichen Dimer rücken und somit inter- molekulare Spaltung innerhalb des Dimers ermöglicht wird. Dabei ist es wichtig, dass die Caspase-8 an beiden Prozessierungsstellen gespalten wird, um die volle Aktivität des Enzyms zu erhalten. Nach der Spaltung erfolgen strukturelle Änderungen in den Loops an der Substratbindungsstelle und den gespaltenen Linkerfragmenten. Dadurch wird die Substratbindungstasche teilweise ausgebildet. Weitere Umlagerungen zur vollständigen Bildung der Bindungstasche erfolgen während der Substratbindung. vii

Diese Arbeit bestätigt den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivierung und Aktivität der Caspase-8. Zusätzlich wird deutlich gemacht, dass pro- teolytische Spaltung eine massgebliche Rolle im Aktivierungsprozess spielt. Die präsentierten Ergebnisse erlauben ein tieferes Verständniss des derzeiti- gen Aktivierungsmechanismusses der Caspase-8 und möglicherweise anderer Caspasen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Grütter Markus G, Hengartner Michael
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:14 Jan 2010 11:55
Last Modified:24 Sep 2019 16:30
Number of Pages:142
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005909422&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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