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Biochemical and structural characterization of cation chloride cotransporters


Warmuth, Stefan. Biochemical and structural characterization of cation chloride cotransporters. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Zusammenfassung Die Kation-Chlorid-Cotransporter (CCCs) stellen eine wichtige Klasse sekundär aktiver Membrantransportproteine dar, die in allen Organen des menschlichen Körpers vorkommen. Sie katalysieren den elektroneutralen Kation Cl- Symport durch die Plasmamembran. CCCs spielen eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellvolumens, beim Transport von Ionen durch Epithelschichten und in der Regulation intrazellulärer Cl- -Konzentrationen. Im Laufe der letzten zwei Jahrzehnte wurden sieben humane Isoformen identifiziert und gemäss dem Kation, welches an den Cl- Transport gekoppelt ist, klassifiziert. Die Erforschung von Transporteigenschaften der humanen Transporter in HEK-293 Zellen ermöglichte die Messung von Ionenaffinitäten und die Identifizierung von Inhibitoren. Zusätzlich zeigten biochemische Experimente die dimere Organisation der NKCCs und die Bedeutung der C-terminalen Domäne für die Homooligomerisation. Obwohl die physiologische Rolle der verschiedenen Transporter bereits im Detail erforscht worden ist, gibt es bis heute keine strukturellen Informationen zu dieser Transporterfamilie. Im Rahmen dieser Dissertation wurden mehrere prokaryotische Homologe der Kation-Chlorid-Cotransporterfamilie identifiziert und deren Expression, Aufreinigung und Kristallisationsverhalten untersucht, um die erste CCC Struktur mit Hilfe der Röntgenstrukturkristallographie zu bestimmen. Das gesamte Protein und die isolierten C-terminalen Domänen dieser Homologe wurden kloniert und deren Expression unter verschiedenen Bedingungen getestet. Die Überexpression des Proteins wurde durch den T7- und PBAD Promoter in E.coli reguliert und für die meisten Proteine konnte dadurch eine Expression herbeigeführt werden. Eine GFP Fusion am C-Terminus wurde als Faltungsindikator verwendet, um frühzeitig Auskunft über die Qualität des Proteins zu erhalten. Nach der Extraktion des Transporters in Detergenzien konnten nur fünf Homologe mit ausreichender Proteinmenge aufgereinigt werden, die weitere biochemische Untersuchungen erlaubte. Obwohl vier der Transporter eine Tendenz zur Aggregation zeigten, nachdem sie aus der Membran gelöst wurden, konnte ein prokaryotisches Homolog aus der Familie der Archäen, Methanosarcina acetivorans C2A, MaCCC, vollständig in verschiedenen Detergenzien aufgereinigt werden. Dieses Konstrukt bildet ein wichtiges Modelsystem für zukünftige strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser Proteinfamilie. Um Einblicke in die strukturelle Organisation der CCC-Transporter zu erhalten, konnte während dieser Dissertation die Struktur der cytosolischen Domäne von MaCCC mit einer Auflösung von 1.9 Å bestimmt werden. Diese Struktur zeigt einen neuen Aufbau einer regulatorischen Einheit von Transportproteinen, und hat Ähnlichkeit mit dem Aufbau von universellen Stressproteinen. Da die Quartärstruktur des Proteins in Kristallen nicht eindeutig war, wurden biochemische Methoden verwendet, um die oligomere Organisation zu charakterisieren. Die analytische Ultrazentrifugation und die Grössenausschlusschromatographie haben gezeigt, dass die Domäne in Lösung Dimere formt. Ein mögliches Dimer Interface, welches in den Kristallen beobachtet wurde, wurde durch zielgerichtete Cysteinmutanten bestätigt, die in der Lage waren, Disulfidbrücken zu bilden. Da der gesamte Transporter ebenso Dimere bildet, konnte mit denselben Crosslinks, die Relevanz der beobachteten Interaktionen für das gesamte Protein gezeigt werden. Die Experimente liefern erste strukturelle Einblicke in die Familie der CCCs und etablieren die dimere Organisation der CCC Transporter. Summary The Cation chloride cotransporters (CCCs) constitute an important class of secondary active membrane transport proteins that are ubiquitously expressed in human. They catalyze the electro-neutral cation-Cl- symport across the plasma membrane. CCCs play an important role in cell volume regulation, the transepithelial movement of ions and the regulation of the intracellular Cl- concentration (Gamba 2005). Seven human isoforms were identified over the last decade and classified according to the cation coupled to Cl- transport. The investigation of transport characteristics of certain human transporters expressed in HEK-293 cells allowed the measurement of ion affinities and the identification of inhibitors. Additional biochemical experiments proposed the dimeric organization of NKCCs and the important role of the C- terminal domain for homo-oligomerization . While the physiological roles of different transporters were investigated in detail, the family still lacks structural representation. In the course of this thesis several prokaryotic homologues of the cation chloride cotransporter family have been identified and were investigated with respect to their expression, purification and crystallization behavior with the goal to determine the first CCC structure by X-ray crystallography. The full-length protein and the isolated C-terminal domain of these homologues were cloned and tested for expression under different conditions. Protein overexpression was investigated in E. coli under the control of the T7- and the PBAD promoters. Under these conditions most proteins showed detectable expression. The addition of a C-terminal GFP fusion was used as folding indicator to determine the quality of the protein at an early stage. After extraction of the full-length transporter in detergents and purification, only five homologues provided sufficient protein for a biochemical characterization. While four of the transporters showed the tendency to aggregate once they were solubilized from the membrane, one prokaryotic homologue from the archaea Methanosarcina acetivorans C2A , MaCCC, allowed the purification of the full-length protein in different detergents. This construct provides an important model system for future structural and functional investigations. To gain insight into the structural organization of CCC transporters the structure of the cytosolic domain of MaCCC was determined in parallel at 1.9 Å resolution. This structure revealed the architecture of a novel fold for a regulatory unit of a transport protein that is distantly related to universal stress proteins. Since the quaternary structure of the protein in the crystals was ambiguous, biochemical methods were used to characterize the oligomeric organization. Analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography revealed that the domain forms dimers in solution. A possible dimer interface observed in the crystals was confirmed by the site-directed introduction of cysteine mutants that were able to form disulfide bonds. Since the full-length transporter also forms dimers, the relevance of the observed interactions was confirmed by forming the same cysteine crosslink in the context of the full-length transporter. The experiments have thus provided a first structural insight into the CCC family and have established the dimeric organization of CCC transporters.

Abstract

Zusammenfassung Die Kation-Chlorid-Cotransporter (CCCs) stellen eine wichtige Klasse sekundär aktiver Membrantransportproteine dar, die in allen Organen des menschlichen Körpers vorkommen. Sie katalysieren den elektroneutralen Kation Cl- Symport durch die Plasmamembran. CCCs spielen eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellvolumens, beim Transport von Ionen durch Epithelschichten und in der Regulation intrazellulärer Cl- -Konzentrationen. Im Laufe der letzten zwei Jahrzehnte wurden sieben humane Isoformen identifiziert und gemäss dem Kation, welches an den Cl- Transport gekoppelt ist, klassifiziert. Die Erforschung von Transporteigenschaften der humanen Transporter in HEK-293 Zellen ermöglichte die Messung von Ionenaffinitäten und die Identifizierung von Inhibitoren. Zusätzlich zeigten biochemische Experimente die dimere Organisation der NKCCs und die Bedeutung der C-terminalen Domäne für die Homooligomerisation. Obwohl die physiologische Rolle der verschiedenen Transporter bereits im Detail erforscht worden ist, gibt es bis heute keine strukturellen Informationen zu dieser Transporterfamilie. Im Rahmen dieser Dissertation wurden mehrere prokaryotische Homologe der Kation-Chlorid-Cotransporterfamilie identifiziert und deren Expression, Aufreinigung und Kristallisationsverhalten untersucht, um die erste CCC Struktur mit Hilfe der Röntgenstrukturkristallographie zu bestimmen. Das gesamte Protein und die isolierten C-terminalen Domänen dieser Homologe wurden kloniert und deren Expression unter verschiedenen Bedingungen getestet. Die Überexpression des Proteins wurde durch den T7- und PBAD Promoter in E.coli reguliert und für die meisten Proteine konnte dadurch eine Expression herbeigeführt werden. Eine GFP Fusion am C-Terminus wurde als Faltungsindikator verwendet, um frühzeitig Auskunft über die Qualität des Proteins zu erhalten. Nach der Extraktion des Transporters in Detergenzien konnten nur fünf Homologe mit ausreichender Proteinmenge aufgereinigt werden, die weitere biochemische Untersuchungen erlaubte. Obwohl vier der Transporter eine Tendenz zur Aggregation zeigten, nachdem sie aus der Membran gelöst wurden, konnte ein prokaryotisches Homolog aus der Familie der Archäen, Methanosarcina acetivorans C2A, MaCCC, vollständig in verschiedenen Detergenzien aufgereinigt werden. Dieses Konstrukt bildet ein wichtiges Modelsystem für zukünftige strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser Proteinfamilie. Um Einblicke in die strukturelle Organisation der CCC-Transporter zu erhalten, konnte während dieser Dissertation die Struktur der cytosolischen Domäne von MaCCC mit einer Auflösung von 1.9 Å bestimmt werden. Diese Struktur zeigt einen neuen Aufbau einer regulatorischen Einheit von Transportproteinen, und hat Ähnlichkeit mit dem Aufbau von universellen Stressproteinen. Da die Quartärstruktur des Proteins in Kristallen nicht eindeutig war, wurden biochemische Methoden verwendet, um die oligomere Organisation zu charakterisieren. Die analytische Ultrazentrifugation und die Grössenausschlusschromatographie haben gezeigt, dass die Domäne in Lösung Dimere formt. Ein mögliches Dimer Interface, welches in den Kristallen beobachtet wurde, wurde durch zielgerichtete Cysteinmutanten bestätigt, die in der Lage waren, Disulfidbrücken zu bilden. Da der gesamte Transporter ebenso Dimere bildet, konnte mit denselben Crosslinks, die Relevanz der beobachteten Interaktionen für das gesamte Protein gezeigt werden. Die Experimente liefern erste strukturelle Einblicke in die Familie der CCCs und etablieren die dimere Organisation der CCC Transporter. Summary The Cation chloride cotransporters (CCCs) constitute an important class of secondary active membrane transport proteins that are ubiquitously expressed in human. They catalyze the electro-neutral cation-Cl- symport across the plasma membrane. CCCs play an important role in cell volume regulation, the transepithelial movement of ions and the regulation of the intracellular Cl- concentration (Gamba 2005). Seven human isoforms were identified over the last decade and classified according to the cation coupled to Cl- transport. The investigation of transport characteristics of certain human transporters expressed in HEK-293 cells allowed the measurement of ion affinities and the identification of inhibitors. Additional biochemical experiments proposed the dimeric organization of NKCCs and the important role of the C- terminal domain for homo-oligomerization . While the physiological roles of different transporters were investigated in detail, the family still lacks structural representation. In the course of this thesis several prokaryotic homologues of the cation chloride cotransporter family have been identified and were investigated with respect to their expression, purification and crystallization behavior with the goal to determine the first CCC structure by X-ray crystallography. The full-length protein and the isolated C-terminal domain of these homologues were cloned and tested for expression under different conditions. Protein overexpression was investigated in E. coli under the control of the T7- and the PBAD promoters. Under these conditions most proteins showed detectable expression. The addition of a C-terminal GFP fusion was used as folding indicator to determine the quality of the protein at an early stage. After extraction of the full-length transporter in detergents and purification, only five homologues provided sufficient protein for a biochemical characterization. While four of the transporters showed the tendency to aggregate once they were solubilized from the membrane, one prokaryotic homologue from the archaea Methanosarcina acetivorans C2A , MaCCC, allowed the purification of the full-length protein in different detergents. This construct provides an important model system for future structural and functional investigations. To gain insight into the structural organization of CCC transporters the structure of the cytosolic domain of MaCCC was determined in parallel at 1.9 Å resolution. This structure revealed the architecture of a novel fold for a regulatory unit of a transport protein that is distantly related to universal stress proteins. Since the quaternary structure of the protein in the crystals was ambiguous, biochemical methods were used to characterize the oligomeric organization. Analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography revealed that the domain forms dimers in solution. A possible dimer interface observed in the crystals was confirmed by the site-directed introduction of cysteine mutants that were able to form disulfide bonds. Since the full-length transporter also forms dimers, the relevance of the observed interactions was confirmed by forming the same cysteine crosslink in the context of the full-length transporter. The experiments have thus provided a first structural insight into the CCC family and have established the dimeric organization of CCC transporters.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Dutzler Raimund
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:14 Jan 2010 12:41
Last Modified:24 Sep 2019 16:30
Number of Pages:112
Additional Information:Enthält Sonderdruck
OA Status:Green
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