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Quest for peptidase activity modifiers : benefits of kinetic strategies


Schenker, Patricia. Quest for peptidase activity modifiers : benefits of kinetic strategies. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Peptidasen sind für die physiologische Aktivierung und den Umsatz von Proteinen unabdingbar. Jedoch können sie in der extrazellulären Matrix der natürlichen Kontrolle entkommen und in der Folge für den Organismus schädlich wirken. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Interaktions- mechanismen zwischen Peptidasen und ihren Modifiern unter Miteinbezug der auffälligen Mikroumgebung bestehend aus Zellen, Enzymen, Inhibitoren und Aktivatoren. Die Unlöslichkeit der das Bindegewebe aufbauen extrazellulären Bestandteile, ist ein zentraler Punkt innerhalb der pharmakologischen Handhabung von pathologischen Peptidasen. Deshalb werden bei Untersuchungen von Pep- tidasen geeignete Werkzeuge benötigt. Bisher wurde der kinetische Mech- anismus einer Enzyminhibition trotz seiner Wichtigkeit in pharmakologis- chen Anwendungen nur geringfügig in die Analysen miteinbezogen. Je- doch kann die Zuordnung eines Modifiers zu seinem Inhibitions-/Aktivations- mechanismus durch sorgfältige in vitro Messungen unterstützend bei der Interpretation von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Proble- men wirken. Wir führten eine systematische Neubeurteilung von Inaktivatoren durch unter Benutzung von Acetylcholinesterase als Modellenzym. In Anbetracht einer umfangreichen Kollektion von häufigen und seltenen Mechanismen stellten wir diagnostische Werkzeuge für die Modelldiskriminierung auf, die anhand praktischer Beispiele getested und validiert wurden. Herkömmliche kompetitive Inhibitoren, die sogenannte ’warheads’ gerichtet gegen das aktive Zentrum einer extrazellulären Matrix abbauenden Peptidase tragen, können ernsthafte Schwierigkeiten in der Erreichung und effektiven Kontrolle ihrer Targets erfahren. Der Grund liegt in der sehr starken An- bindung der Enzyme an ihre unlöslichen Substrate von denen sie während ihrer Zeit im Gewebe praktisch nicht weg dissoziieren. Wir identifizierten ein Molekül das ausserhalb der aktiven Stelle von Cathepsin B bindet und die Flexibilität eines strukturellen Schlüsselelementes, verantwortlich für die Exo- und Endopeptidaseaktivität des Enzyms, kontrolliert. Solche und ähn- liche Inhibitoren welche konstruierte Strukturen besitzen die ausserhalb der VI | aktiven Stelle eines Enzyms binden auch wenn dieses fest an ein Substrat gebunden ist, repräsentieren wertvolle Kantidaten für die pharmakologische Kontrolle von pathologischen Peptidasen. Künstlich hergestellte Modifier welche ausserhalb des aktiven Zentrums eines Enzyms binden, können mit den natürlich vorkommenden Inhibitoren wie auch unspezifischen Liganden, z.B. Komponeten der extrazellulären Matrix, in Wechselwirkung treten. Wir arbeiteten ein kinetischen Modell aus um die doppelte Interaktion zwischen Modifiern und Enzymen zu beschreiben, was in der Vorhersage von ’Synergy’, ’Zero-Interaction’ und ’Antagonism’ zwischen Inhibitoren und/oder Aktivatoren benutzt werden kann, wie auch für die nicht-lineare Regressionsanalyse von experimentellen Daten. Gewöhliche, ungewöhnliche aber auch sonderbare Effekte hervorgerufen durch die Kombination von zwei Modifiern, wie beispielsweise die Reaktivierung bei hoher Modifierkonzentration nach einer unsprünglichen Inhibition bei tiefen Modifierkonzentration, können quantitativ durch die Zuhilfenahme von einfach zu benützenden kinetischen Gleichungen interpretiert werden. Die theoretische Behandlung konnte für die Interpretation der rätselhaften Resultate eingesetzt werden, welche sich bei der Interaktion von Elastase-2 mit Glykosaminoglykanen zeigten. Summary

Peptidases are indispensable for physiological activation and turnover of pro- teins but in the extracellular space they may escape control and be harmful to the organism. This thesis focuses on the mechanism of interaction between peptidases and modifiers taking into account the peculiar microenvironment concerned with cells, enzymes, inhibitors and activators. The insoluble nature of extracellular matrix components, which build up connective tissues, is a central point in the pharmacological management of pathological peptidases, for which adequate investigation tools are nec- essary. The kinetic mechanism of inhibition of enzyme modifiers designed for pharmacological applications has been considered so far only marginally but is nevertheless of paramount importance. Indeed, ascribing modifiers to their correct inhibition/activation category by kinetic studies carefully per- formed in vitro, provide support to the interpretation of pharmacokinetic and pharmacodynamic issues. We performed a systematic re-evaluation of enzyme inactivators using acetyl- cholinesterase as a model enzyme. Considering a comprehensive collection of common and rare mechanisms of action, we set up diagnostic tools for model discrimination, which were tested and validated with practical examples. Conventional, competitive inhibitors carrying warheads directed to the active center of extracellular matrix degrading peptidases may experience serious difficulties in reaching and effectively controlling their targets. This occurs because the enzymes are tightly bound to their insoluble substrates and vir- tually do not detach during their permanence in the tissues. We identified a compound that binds outside the catalytic center of cathepsin B and con- trols the flexibility of a key structural element, which is responsible for the exo- and endopeptidase activity of the enzyme. This and similar inhibitors possessing engineered structures that bind to accessible sites of the target enzymes, even when these are tightly bound to their substrates, represent valuable candidates for the pharmacological control of pathological pepti- dases. IV | Summary

Artificially designed modifiers target outside the active site of enzymes may be engaged in multiple interactions with naturally occurring inhibitors as well as with unspecific ligands such as components of the extracellular ma- trix. We elaborated a kinetic model for describing double interaction between modifiers and enzymes, which assists in making predictions of synergy, zero- interaction and antagonism between inhibitors and/or activators and can be used for non-linear regression analysis of experimental data as well. Ordinary, uncommon and even bizarre effects brought about by the combi- nation of two modifiers, such as reactivation at high effector concentration following inhibition at low concentration, can be quantitatively interpreted with the aid of easy-to-use kinetic equations. The theoretical treatment could be used for interpreting puzzling results obtained with elastase-2 in interaction with sulfated glycosaminoglycans.

Abstract

Peptidasen sind für die physiologische Aktivierung und den Umsatz von Proteinen unabdingbar. Jedoch können sie in der extrazellulären Matrix der natürlichen Kontrolle entkommen und in der Folge für den Organismus schädlich wirken. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Interaktions- mechanismen zwischen Peptidasen und ihren Modifiern unter Miteinbezug der auffälligen Mikroumgebung bestehend aus Zellen, Enzymen, Inhibitoren und Aktivatoren. Die Unlöslichkeit der das Bindegewebe aufbauen extrazellulären Bestandteile, ist ein zentraler Punkt innerhalb der pharmakologischen Handhabung von pathologischen Peptidasen. Deshalb werden bei Untersuchungen von Pep- tidasen geeignete Werkzeuge benötigt. Bisher wurde der kinetische Mech- anismus einer Enzyminhibition trotz seiner Wichtigkeit in pharmakologis- chen Anwendungen nur geringfügig in die Analysen miteinbezogen. Je- doch kann die Zuordnung eines Modifiers zu seinem Inhibitions-/Aktivations- mechanismus durch sorgfältige in vitro Messungen unterstützend bei der Interpretation von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Proble- men wirken. Wir führten eine systematische Neubeurteilung von Inaktivatoren durch unter Benutzung von Acetylcholinesterase als Modellenzym. In Anbetracht einer umfangreichen Kollektion von häufigen und seltenen Mechanismen stellten wir diagnostische Werkzeuge für die Modelldiskriminierung auf, die anhand praktischer Beispiele getested und validiert wurden. Herkömmliche kompetitive Inhibitoren, die sogenannte ’warheads’ gerichtet gegen das aktive Zentrum einer extrazellulären Matrix abbauenden Peptidase tragen, können ernsthafte Schwierigkeiten in der Erreichung und effektiven Kontrolle ihrer Targets erfahren. Der Grund liegt in der sehr starken An- bindung der Enzyme an ihre unlöslichen Substrate von denen sie während ihrer Zeit im Gewebe praktisch nicht weg dissoziieren. Wir identifizierten ein Molekül das ausserhalb der aktiven Stelle von Cathepsin B bindet und die Flexibilität eines strukturellen Schlüsselelementes, verantwortlich für die Exo- und Endopeptidaseaktivität des Enzyms, kontrolliert. Solche und ähn- liche Inhibitoren welche konstruierte Strukturen besitzen die ausserhalb der VI | aktiven Stelle eines Enzyms binden auch wenn dieses fest an ein Substrat gebunden ist, repräsentieren wertvolle Kantidaten für die pharmakologische Kontrolle von pathologischen Peptidasen. Künstlich hergestellte Modifier welche ausserhalb des aktiven Zentrums eines Enzyms binden, können mit den natürlich vorkommenden Inhibitoren wie auch unspezifischen Liganden, z.B. Komponeten der extrazellulären Matrix, in Wechselwirkung treten. Wir arbeiteten ein kinetischen Modell aus um die doppelte Interaktion zwischen Modifiern und Enzymen zu beschreiben, was in der Vorhersage von ’Synergy’, ’Zero-Interaction’ und ’Antagonism’ zwischen Inhibitoren und/oder Aktivatoren benutzt werden kann, wie auch für die nicht-lineare Regressionsanalyse von experimentellen Daten. Gewöhliche, ungewöhnliche aber auch sonderbare Effekte hervorgerufen durch die Kombination von zwei Modifiern, wie beispielsweise die Reaktivierung bei hoher Modifierkonzentration nach einer unsprünglichen Inhibition bei tiefen Modifierkonzentration, können quantitativ durch die Zuhilfenahme von einfach zu benützenden kinetischen Gleichungen interpretiert werden. Die theoretische Behandlung konnte für die Interpretation der rätselhaften Resultate eingesetzt werden, welche sich bei der Interaktion von Elastase-2 mit Glykosaminoglykanen zeigten. Summary

Peptidases are indispensable for physiological activation and turnover of pro- teins but in the extracellular space they may escape control and be harmful to the organism. This thesis focuses on the mechanism of interaction between peptidases and modifiers taking into account the peculiar microenvironment concerned with cells, enzymes, inhibitors and activators. The insoluble nature of extracellular matrix components, which build up connective tissues, is a central point in the pharmacological management of pathological peptidases, for which adequate investigation tools are nec- essary. The kinetic mechanism of inhibition of enzyme modifiers designed for pharmacological applications has been considered so far only marginally but is nevertheless of paramount importance. Indeed, ascribing modifiers to their correct inhibition/activation category by kinetic studies carefully per- formed in vitro, provide support to the interpretation of pharmacokinetic and pharmacodynamic issues. We performed a systematic re-evaluation of enzyme inactivators using acetyl- cholinesterase as a model enzyme. Considering a comprehensive collection of common and rare mechanisms of action, we set up diagnostic tools for model discrimination, which were tested and validated with practical examples. Conventional, competitive inhibitors carrying warheads directed to the active center of extracellular matrix degrading peptidases may experience serious difficulties in reaching and effectively controlling their targets. This occurs because the enzymes are tightly bound to their insoluble substrates and vir- tually do not detach during their permanence in the tissues. We identified a compound that binds outside the catalytic center of cathepsin B and con- trols the flexibility of a key structural element, which is responsible for the exo- and endopeptidase activity of the enzyme. This and similar inhibitors possessing engineered structures that bind to accessible sites of the target enzymes, even when these are tightly bound to their substrates, represent valuable candidates for the pharmacological control of pathological pepti- dases. IV | Summary

Artificially designed modifiers target outside the active site of enzymes may be engaged in multiple interactions with naturally occurring inhibitors as well as with unspecific ligands such as components of the extracellular ma- trix. We elaborated a kinetic model for describing double interaction between modifiers and enzymes, which assists in making predictions of synergy, zero- interaction and antagonism between inhibitors and/or activators and can be used for non-linear regression analysis of experimental data as well. Ordinary, uncommon and even bizarre effects brought about by the combi- nation of two modifiers, such as reactivation at high effector concentration following inhibition at low concentration, can be quantitatively interpreted with the aid of easy-to-use kinetic equations. The theoretical treatment could be used for interpreting puzzling results obtained with elastase-2 in interaction with sulfated glycosaminoglycans.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Caflisch Amedeo, Baici Antonio
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:14 Jan 2010 12:45
Last Modified:24 Sep 2019 16:30
Number of Pages:134
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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