Abstract
Peptidasen sind für die physiologische Aktivierung und den Umsatz von Proteinen unabdingbar. Jedoch können sie in der extrazellulären Matrix der natürlichen Kontrolle entkommen und in der Folge für den Organismus schädlich wirken. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Interaktionsmechanismen zwischen Peptidasen und ihren Modifiern unter Miteinbezug der auffälligen Mikroumgebung bestehend aus Zellen, Enzymen, Inhibitoren und Aktivatoren. Die Unlöslichkeit der das Bindegewebe aufbauen extrazellulären Bestandteile, ist ein zentraler Punkt innerhalb der pharmakologischen Handhabung von pathologischen Peptidasen. Deshalb werden bei Untersuchungen von Peptidasen geeignete Werkzeuge benötigt. Bisher wurde der kinetische Mechanismus einer Enzyminhibition trotz seiner Wichtigkeit in pharmakologischen Anwendungen nur geringfügig in die Analysen miteinbezogen. Jedoch kann die Zuordnung eines Modifiers zu seinem Inhibitions-/Aktivationsmechanismus durch sorgfältige in vitro Messungen unterstützend bei der Interpretation von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Problemen wirken. Wir führten eine systematische Neubeurteilung von Inaktivatoren durch unter Benutzung von Acetylcholinesterase als Modellenzym. In Anbetracht einer umfangreichen Kollektion von häufigen und seltenen Mechanismen stellten wir diagnostische Werkzeuge für die Modelldiskriminierung auf, die anhand praktischer Beispiele getested und validiert wurden. Herkömmliche kompetitive Inhibitoren, die sogenannte ’warheads’ gerichtet gegen das aktive Zentrum einer extrazellulären Matrix abbauenden Peptidase tragen, können ernsthafte Schwierigkeiten in der Erreichung und effektiven Kontrolle ihrer Targets erfahren. Der Grund liegt in der sehr starken Anbindung der Enzyme an ihre unlöslichen Substrate von denen sie während ihrer Zeit im Gewebe praktisch nicht weg dissoziieren. Wir identifizierten ein Molekül das ausserhalb der aktiven Stelle von Cathepsin B bindet und die Flexibilität eines strukturellen Schlüsselelementes, verantwortlich für die Exo- und Endopeptidaseaktivität des Enzyms, kontrolliert. Solche und ähnliche Inhibitoren welche konstruierte Strukturen besitzen die ausserhalb der aktiven Stelle eines Enzyms binden auch wenn dieses fest an ein Substrat gebunden ist, repräsentieren wertvolle Kantidaten für die pharmakologische Kontrolle von pathologischen Peptidasen. Künstlich hergestellte Modifier welche ausserhalb des aktiven Zentrums eines Enzyms binden, können mit den natürlich vorkommenden Inhibitoren wie auch unspezifischen Liganden, z.B. Komponeten der extrazellulären Matrix, in Wechselwirkung treten. Wir arbeiteten ein kinetischen Modell aus um die doppelte Interaktion zwischen Modifiern und Enzymen zu beschreiben, was in der Vorhersage von ’Synergy’, ’Zero-Interaction’ und ’Antagonism’ zwischen Inhibitoren und/oder Aktivatoren benutzt werden kann, wie auch für die nicht-lineare Regressionsanalyse von experimentellen Daten. Gewöhliche, ungewöhnliche aber auch sonderbare Effekte hervorgerufen durch die Kombination von zwei Modifiern, wie beispielsweise die Reaktivierung bei hoher Modifierkonzentration nach einer unsprünglichen Inhibition bei tiefen Modifierkonzentration, können quantitativ durch die Zuhilfenahme von einfach zu benützenden kinetischen Gleichungen interpretiert werden. Die theoretische Behandlung konnte für die Interpretation der rätselhaften Resultate eingesetzt werden, welche sich bei der Interaktion von Elastase-2 mit Glykosaminoglykanen zeigten.
Summary
Peptidases are indispensable for physiological activation and turnover of proteins but in the extracellular space they may escape control and be harmful to the organism. This thesis focuses on the mechanism of interaction between peptidases and modifiers taking into account the peculiar microenvironment concerned with cells, enzymes, inhibitors and activators. The insoluble nature of extracellular matrix components, which build up connective tissues, is a central point in the pharmacological management of pathological peptidases, for which adequate investigation tools are necessary. The kinetic mechanism of inhibition of enzyme modifiers designed for pharmacological applications has been considered so far only marginally but is nevertheless of paramount importance. Indeed, ascribing modifiers to their correct inhibition/activation category by kinetic studies carefully performed in vitro, provide support to the interpretation of pharmacokinetic and pharmacodynamic issues. We performed a systematic re-evaluation of enzyme inactivators using acetylcholinesterase as a model enzyme. Considering a comprehensive collection of common and rare mechanisms of action, we set up diagnostic tools for model discrimination, which were tested and validated with practical examples. Conventional, competitive inhibitors carrying warheads directed to the active center of extracellular matrix degrading peptidases may experience serious difficulties in reaching and effectively controlling their targets. This occurs because the enzymes are tightly bound to their insoluble substrates and virtually do not detach during their permanence in the tissues. We identified a compound that binds outside the catalytic center of cathepsin B and controls the flexibility of a key structural element, which is responsible for the exo- and endopeptidase activity of the enzyme. This and similar inhibitors possessing engineered structures that bind to accessible sites of the target enzymes, even when these are tightly bound to their substrates, represent valuable candidates for the pharmacological control of pathological peptidases. Artificially designed modifiers target outside the active site of enzymes may be engaged in multiple interactions with naturally occurring inhibitors as well as with unspecific ligands such as components of the extracellular matrix. We elaborated a kinetic model for describing double interaction between modifiers and enzymes, which assists in making predictions of synergy, zero-interaction and antagonism between inhibitors and/or activators and can be used for non-linear regression analysis of experimental data as well. Ordinary, uncommon and even bizarre effects brought about by the combination of two modifiers, such as reactivation at high effector concentration following inhibition at low concentration, can be quantitatively interpreted with the aid of easy-to-use kinetic equations. The theoretical treatment could be used for interpreting puzzling results obtained with elastase-2 in interaction with sulfated glycosaminoglycans.
Schenker, Patricia