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Designed degradation of a specific protein in the cell


Vincent, Myriam. Designed degradation of a specific protein in the cell. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

In eukaryotes, the majority of intracellular proteins are degraded by a 2.5 megadaltons multimeric assembly, the proteasome. This giant self-compartmentalizing protease ensures the quality of intracellular proteins and controls numerous cellular processes by regulating the break-down of key regulatory proteins. Selectively depleting intracellular proteins could open a new avenue for protein function analysis and therapeutic applications. It can be achieved by specifically leading the protein of interest to the proteasome for degradation. Several protein knock-out techniques were developed, but engineered degradation has so far been successfully applied to very few proteins only, and every time redesigned case by case. To further assess the potential of protein knock-out, we chose to use a common binding scaffold, DARPins, for the design of diverse generalizable effector proteins, meant to degrade any kind of target protein.

The proteasome functions primarily to break down proteins which have been covalently modified with a polyubiquitin tag. Ubiquitin protein ligases (E3) are the enzymes responsible for the substrate specificity of the ubiquitination reaction. We aimed at altering their recognition function to ubiquitinate selected proteins. SCF (Skp1 - Cullin - F-Box protein) ubiquitin ligases, a well characterized family of multisubunit E3 enzymes, were exploited to achieve designed degradation. They contain a core enzymatic structure and an interchangeable F-Box protein subunit, which is responsible for the SCF substrate specificity. A chimeric F-box protein was engineered using DARPin to provide an artificial specificity domain. In S. cerevisiae, a chimeric F-box protein could specifically destabilize a cognate target protein in a SCF- and proteasome-dependent manner. The chimeric F box protein was further reengineered in order to better investigate how F-box proteins mediate ubiquitination. A deeper understanding of the ubiquitination machinery was gained but the target protein degradation efficiency stayed limited.

An ubiquitin free route was also used as an alternative strategy for degrading selected proteins. A small subset of proteins is degraded by the proteasome without prior ubiquitination. These proteins contain a degradation signal, named degron, enabling a direct interaction with the proteasome. The ODC and NYV degron sequences, originating from the mouse ornithine decarboxylase and the G1 glycoprotein of NY-1V hantavirus, respectively, were evaluated in S. cerevisiae. Different kinds of target proteins, among which highly stable ones like DARPins, were very rapidly degraded by the proteasome, when the ODC- or NYV-degron was fused to their C termini. We then assessed if a degron could work in trans to induce degradation of a binding partner. A DARPin-degron was co-expressed with a cognate target protein in S. cerevisiae. Whereas the DARPin-degron was quickly degraded, the levels of the target protein were not affected. In mammalian cells, DARPin-degron constructs could be targeted to the proteasome with a lower rate than in S. cerevisiae. In spite of more favorable interaction conditions and complex formation, a co-expressed cognate target protein was still not co-degraded.



1 Targeted degradation may be very valuable for the complete removal of proteins potentially toxic for the cell such as oncoproteins, viral proteins and stabilized proteins in neurodegenerative diseases. Our experimental data indicate that targeting a selected protein to the proteasome might not be enough to turn it into an eligible substrate. The proteasome might require specific substrate characteristics to achieve efficient degradation, making the development of a general protein knock-out strategy more challenging than it was previously assumed.



In Eukaryoten wird die Merheit der intrazellulären Proteine vom Proteasom, einem 2.5 Megadalton multimerischen Komplex abgebaut. Diese gigantische Protease ist verantwortlich für die Qualität der intrazellulären Proteine und kontrolliert zahlreiche zelluläre Prozesse durch den Abbau von Proteinen mit Schlüsselfunktionen. Der spezifische Abbau von intrazellulären Proteinen könnte einen neuen Weg für die Funktionsanalyse von Proteinen eröffnen und zudem eine therapeutische Anwedung haben. Eine Möglichkeit, um ein bestimmtes Zielprotein abzubauen, ist es dieses spezifisch zum Proteasom zu führen. Mehrere Protein-knock-out-Techniken/Strategien wurden entwickelt, konnten bis zum jetzigen Zeitpunkt aber nur für ein begrenzte Reihe von Proteinen bewiesen werden. Zudem musste das Verfahren für jedes Zielprotein einzeln optimiert werden. Um das Potenzial von Protein-knock-out- Strategien richtig einzuschätzen, haben wir ein generelles proteinbindendes Molekül, DARPIns, zu Hilfe genommen. Mithilfe dieser DARPins wurden verschiedene Effektor moleküle hergestellt, welche den Abbau von beliebigen Protein ermöglichen sollten.

Das Proteasom zerstört hauptsächlich Proteine, an die eine Polyubiquitinkette angehängt wurde. Ubiquitin-Protein-Ligasen (E3) sind diejenigen Enzyme, die für die Spezifizität der Ubiquitinierungsreaktion verantwortlich sind. Eine Strategie verfolgte die Modifizierung der Erkennungsfunktion der E3-Ligasen, so dass diese ein Zielprotein für die Ubiquitinierungsreaktion auswählen würden. SCF (Skp1 - Cullin - F-Box protein)- Ubiquitin-Ligasen, eine Familie von multimerischen E3-Enzymen, wurden genutzt um spezifischen Abbau zu ermöglichen. Der SCF Komplex besteht aus einer enzymatischen Kernstruktur und einem austauschbaren Faktor, dem F-box-Protein. Dieses funktioniert wie ein Adaptor, der spezifisch Substrate in der Zelle rekrutiert. Mithilfe von DARPins wurde ein chimäres F-box-Protein konstruiert, welches eine künstlichen Substraterkennungsstruktur besitzt. In Anwesenheit eines chimären F-box Proteins konnte ein bestimmtes Zielprotein spezifisch durch die SCF-Ligase und das Proteasom abgebaut werden, falls beide in S. cerevisiae coexprimiert wurden. Das chimäre F-box Protein wurde weiterentwickelt, um genauer zu analysieren, wie F-box- Proteine den Proteinabbau steuern. Die erhaltenen Ergebnisse führten zu einem besseren Verständnis des Ubiquitinierungsprozesses; die Effizienz des Proteinabbaus blieb jedoch begrenzt.



2 Eine alternativer Ansatz nutzte einen Ubiquitin-freien Weg, um ein Zielprotein zum Proteasom zu bringen. Eine kleine Gruppe von Proteinen benötigt keine Ubiquitinierung, um abgebaut zu werden. Sie erhalten eine kleine Sequenz – Degron genannt - die direkt mit dem Proteasom interagiert. Die Effekte des ODC(Maus Ornithine Decarboxylase)-Degrons und des NYV(G1 Glycoprotein des NY-1V Hantaviruses)-Degrons wurden im S. cerevisiae untersucht. Verschiedene Proteine, unter diesen hoch stabile Proteine wie DARPins, wurden sehr schnell durch das Proteasom abgebaut, falls eine dieser Degron-Sequenzen am C-Terminus fusioniert wurde. Ein DARPin-Degron-Fusionsprotein wurde mit einem bindenden Zielprotein in S. cerevisiae exprimiert. Das DARPin-degron wurde schnell abgebaut, während das bindende Zielprotein stabil blieb. In humanen Zellen wurden die DARPin-degron-Fusionen weniger schnell als in S. cerevisiae abgebaut. Die Vorraussetzungen für Interaktionen mit dem Zielprotein und den Komplexeinbau waren gegeben, jedoch wurde das Zielprotein dennoch nicht abgebaut.

Gezielter Abbau von Proteinen wäre ein wertvolles Werkzeug um toxische Proteine, die Krankheiten verursachen (zum Beispiel Onkoproteine, virale Proteine, oder stabile Proteine typisch für neurodegenerative Erkrankungen), zu entfernen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nicht ausreicht ein beliebendes Protein zum Proteasom zu schicken um seinen Abbau auszulösen. Der Proteinabbau durch das Proteasom erfordert vielleicht zusätzliche Proteineigenschaften, damit es als Substrat behandelt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Entwicklung einer generellen Protein-knock-out-Strategie herausfordernder als vorausgesetzt.



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Abstract

In eukaryotes, the majority of intracellular proteins are degraded by a 2.5 megadaltons multimeric assembly, the proteasome. This giant self-compartmentalizing protease ensures the quality of intracellular proteins and controls numerous cellular processes by regulating the break-down of key regulatory proteins. Selectively depleting intracellular proteins could open a new avenue for protein function analysis and therapeutic applications. It can be achieved by specifically leading the protein of interest to the proteasome for degradation. Several protein knock-out techniques were developed, but engineered degradation has so far been successfully applied to very few proteins only, and every time redesigned case by case. To further assess the potential of protein knock-out, we chose to use a common binding scaffold, DARPins, for the design of diverse generalizable effector proteins, meant to degrade any kind of target protein.

The proteasome functions primarily to break down proteins which have been covalently modified with a polyubiquitin tag. Ubiquitin protein ligases (E3) are the enzymes responsible for the substrate specificity of the ubiquitination reaction. We aimed at altering their recognition function to ubiquitinate selected proteins. SCF (Skp1 - Cullin - F-Box protein) ubiquitin ligases, a well characterized family of multisubunit E3 enzymes, were exploited to achieve designed degradation. They contain a core enzymatic structure and an interchangeable F-Box protein subunit, which is responsible for the SCF substrate specificity. A chimeric F-box protein was engineered using DARPin to provide an artificial specificity domain. In S. cerevisiae, a chimeric F-box protein could specifically destabilize a cognate target protein in a SCF- and proteasome-dependent manner. The chimeric F box protein was further reengineered in order to better investigate how F-box proteins mediate ubiquitination. A deeper understanding of the ubiquitination machinery was gained but the target protein degradation efficiency stayed limited.

An ubiquitin free route was also used as an alternative strategy for degrading selected proteins. A small subset of proteins is degraded by the proteasome without prior ubiquitination. These proteins contain a degradation signal, named degron, enabling a direct interaction with the proteasome. The ODC and NYV degron sequences, originating from the mouse ornithine decarboxylase and the G1 glycoprotein of NY-1V hantavirus, respectively, were evaluated in S. cerevisiae. Different kinds of target proteins, among which highly stable ones like DARPins, were very rapidly degraded by the proteasome, when the ODC- or NYV-degron was fused to their C termini. We then assessed if a degron could work in trans to induce degradation of a binding partner. A DARPin-degron was co-expressed with a cognate target protein in S. cerevisiae. Whereas the DARPin-degron was quickly degraded, the levels of the target protein were not affected. In mammalian cells, DARPin-degron constructs could be targeted to the proteasome with a lower rate than in S. cerevisiae. In spite of more favorable interaction conditions and complex formation, a co-expressed cognate target protein was still not co-degraded.



1 Targeted degradation may be very valuable for the complete removal of proteins potentially toxic for the cell such as oncoproteins, viral proteins and stabilized proteins in neurodegenerative diseases. Our experimental data indicate that targeting a selected protein to the proteasome might not be enough to turn it into an eligible substrate. The proteasome might require specific substrate characteristics to achieve efficient degradation, making the development of a general protein knock-out strategy more challenging than it was previously assumed.



In Eukaryoten wird die Merheit der intrazellulären Proteine vom Proteasom, einem 2.5 Megadalton multimerischen Komplex abgebaut. Diese gigantische Protease ist verantwortlich für die Qualität der intrazellulären Proteine und kontrolliert zahlreiche zelluläre Prozesse durch den Abbau von Proteinen mit Schlüsselfunktionen. Der spezifische Abbau von intrazellulären Proteinen könnte einen neuen Weg für die Funktionsanalyse von Proteinen eröffnen und zudem eine therapeutische Anwedung haben. Eine Möglichkeit, um ein bestimmtes Zielprotein abzubauen, ist es dieses spezifisch zum Proteasom zu führen. Mehrere Protein-knock-out-Techniken/Strategien wurden entwickelt, konnten bis zum jetzigen Zeitpunkt aber nur für ein begrenzte Reihe von Proteinen bewiesen werden. Zudem musste das Verfahren für jedes Zielprotein einzeln optimiert werden. Um das Potenzial von Protein-knock-out- Strategien richtig einzuschätzen, haben wir ein generelles proteinbindendes Molekül, DARPIns, zu Hilfe genommen. Mithilfe dieser DARPins wurden verschiedene Effektor moleküle hergestellt, welche den Abbau von beliebigen Protein ermöglichen sollten.

Das Proteasom zerstört hauptsächlich Proteine, an die eine Polyubiquitinkette angehängt wurde. Ubiquitin-Protein-Ligasen (E3) sind diejenigen Enzyme, die für die Spezifizität der Ubiquitinierungsreaktion verantwortlich sind. Eine Strategie verfolgte die Modifizierung der Erkennungsfunktion der E3-Ligasen, so dass diese ein Zielprotein für die Ubiquitinierungsreaktion auswählen würden. SCF (Skp1 - Cullin - F-Box protein)- Ubiquitin-Ligasen, eine Familie von multimerischen E3-Enzymen, wurden genutzt um spezifischen Abbau zu ermöglichen. Der SCF Komplex besteht aus einer enzymatischen Kernstruktur und einem austauschbaren Faktor, dem F-box-Protein. Dieses funktioniert wie ein Adaptor, der spezifisch Substrate in der Zelle rekrutiert. Mithilfe von DARPins wurde ein chimäres F-box-Protein konstruiert, welches eine künstlichen Substraterkennungsstruktur besitzt. In Anwesenheit eines chimären F-box Proteins konnte ein bestimmtes Zielprotein spezifisch durch die SCF-Ligase und das Proteasom abgebaut werden, falls beide in S. cerevisiae coexprimiert wurden. Das chimäre F-box Protein wurde weiterentwickelt, um genauer zu analysieren, wie F-box- Proteine den Proteinabbau steuern. Die erhaltenen Ergebnisse führten zu einem besseren Verständnis des Ubiquitinierungsprozesses; die Effizienz des Proteinabbaus blieb jedoch begrenzt.



2 Eine alternativer Ansatz nutzte einen Ubiquitin-freien Weg, um ein Zielprotein zum Proteasom zu bringen. Eine kleine Gruppe von Proteinen benötigt keine Ubiquitinierung, um abgebaut zu werden. Sie erhalten eine kleine Sequenz – Degron genannt - die direkt mit dem Proteasom interagiert. Die Effekte des ODC(Maus Ornithine Decarboxylase)-Degrons und des NYV(G1 Glycoprotein des NY-1V Hantaviruses)-Degrons wurden im S. cerevisiae untersucht. Verschiedene Proteine, unter diesen hoch stabile Proteine wie DARPins, wurden sehr schnell durch das Proteasom abgebaut, falls eine dieser Degron-Sequenzen am C-Terminus fusioniert wurde. Ein DARPin-Degron-Fusionsprotein wurde mit einem bindenden Zielprotein in S. cerevisiae exprimiert. Das DARPin-degron wurde schnell abgebaut, während das bindende Zielprotein stabil blieb. In humanen Zellen wurden die DARPin-degron-Fusionen weniger schnell als in S. cerevisiae abgebaut. Die Vorraussetzungen für Interaktionen mit dem Zielprotein und den Komplexeinbau waren gegeben, jedoch wurde das Zielprotein dennoch nicht abgebaut.

Gezielter Abbau von Proteinen wäre ein wertvolles Werkzeug um toxische Proteine, die Krankheiten verursachen (zum Beispiel Onkoproteine, virale Proteine, oder stabile Proteine typisch für neurodegenerative Erkrankungen), zu entfernen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nicht ausreicht ein beliebendes Protein zum Proteasom zu schicken um seinen Abbau auszulösen. Der Proteinabbau durch das Proteasom erfordert vielleicht zusätzliche Proteineigenschaften, damit es als Substrat behandelt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Entwicklung einer generellen Protein-knock-out-Strategie herausfordernder als vorausgesetzt.



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Plückthun Andreas
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:14 Jan 2010 13:00
Last Modified:24 Sep 2019 16:30
Number of Pages:179
OA Status:Green
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