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Structural analysis of DARPin mutants and biochemical characterization of ABC transporters and SGT1


Kramer, Michaela Andrea. Structural analysis of DARPin mutants and biochemical characterization of ABC transporters and SGT1. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Abstracts

My PhD thesis focuses on the structure analysis of proteins by X-ray crystallography, namely bacterial membrane proteins from the family of ABC transporters, the inflammasome adaptor protein SGT1 and Designed Ankyrin Repeat Proteins. These three topics will be summarized below.

Several ABC-transporters of Escherichia coli have been selected for recombinant expression and purification. By screening of several constructs and expression conditions the ABC-transporters YojI, MclB and HlyB were expressed. The purification protocol for the microcin exporter YojI was optimized and it was shown that YojI forms a stable dimer. This protein was used for functional assays. The obtained results form the basis for an increased understanding of the function of ABC-transporters.

The human protein SGT1 was expressed and characterized by biophysical methods. This protein is involved in the pathogen defence reactionin the mammalian immunesystem and its planhomologue is involved in the hypersensitivity response. Since the full length protein SGT1 did not yield crystals, we used limited proteolysis to obtain fragments that might be amendable for crystallization. Several fragments were obtained, cloned and overexpressed. For the central CS-domain an X-ray structures became available during my PhD thesis, for the N-terminal TPR domain structures of homologues were elucidated. The C-terminal SGS-domain revealed a limited degree of folding. The gained information is useful for further immuno-assays in order to determine interaction partners. Selected Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) were structurally analysed. DARPins are extremely stable repeat proteins having a vast field of application as inhibitors and as crystallization aids. Previous studies have shown that the C-terminal capping repeat is limiting the stablility of these molecules. Therefore the group of Prof. A. Plückthun designed new C-terminal caps that showed improved thermal stability. To analyse the structural determinants for this improved thermal stability the DARPins NI1C mutant 4, NI3C mutant 5 and NI3C mutant 6 were crystallized. The crystal structures revealed an improved packing between the C-terminal capping repeat and the last internal repeat explaining the improved thermal stabilityof the new design. Meine Dissertation beschäftigt sich mit der Röntgenstrukturanalyse von Proteinen. Zu diesen gehörten Mitglieder der Familie der ABC-transporter, das Inflammasome-Adapter- Protein SGT1 und den sogenannte Designed Ankyrin Repeat Proteins, welche folgend kurz beschrieben werden.

Eine Auswahl ABC-Transporter aus dem Organismus Escherichia coli wurde selektioniert, um eine einfache Expression zu gewährleisten. Bei dem Screening von verschiedenen Konstrukte und Expressionsbedingungen konnten die ABC-transporter YojI, MclB und HlyB expremiert werden. Es wurde gezeigt, dass der Microcin-exproter YojI ein stabiles Dimer bildet welcher für funktionelle Analysen genutzt wurde. Die hieraus hervorgegangenen Resultate werden eine Basis für das Verständnis der Funktion der ABC-Transporter von Nutzen sein.

Das humane Protein SGT1 wurde aufgereingt und durch biophysikalische Messmethoden charakterisiert. Dieses Protein ist in der Abwehrreaktion von Pathogenen in der Immunantwort des Säugetiers und sein pflanzliches Homolog in der so genannten Hypersensitivitätsreaktion beteiligt. Da das Protein SGT1 keine Kristalle bildete, wurden mit Hilfe von limitierten Proteolyseversuchen Fragmente bestimmt, welche die Kristallbildung vereinfachen sollen. Die dabei erhaltenen Fragmente wurden kloniert und aufgereinigt. Während dieser Arbeit wurde eine Struktur der mittleren CS-Untereinheit mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt, für die amino-terminale TPR-Untereinheit wurden Strukturen von Homologen bekannt. Die carboxy-terminale SGS-Unterinheit zeigte einen beschränkten Anteil an Faltung. Die erhaltenen Informationen können für die Ermittlung von Interaktionspartnern durch Immunoassays dienen.

Ausgewählte Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) wurden strukturbiologisch analysiert. DARPins sind extrem stabile Proteine welche aus sich wiederholenden Aminosäuresequenzen bestehen. Diese Proteine zeichnen sich durch eine weit gefächerte Anwendungsvielfalt aus, wie zum Beispiel ihr Nutzen als Inhibitoren und als Kristallisationshilfen. Vorangegangene Studien zeigten, dass die C-terminal Wiederholung die Stabilität dieser Moleküle limitiert. Deshalb entwarf die Gruppe von Prof. A. Plückthun diese C-terminale Wiederholung neu, ihre Resultate wiesen erhöhten thermischen Stabilitäten auf. Um die strukturellen Faktoren für diese verbesserte Stabilitäten zu bestimmen, wurden die DARPins NI1C mutant 4, NI3C mutant 5 and NI3C mutant 6 kristallisiert. Die Röntgenkristallstrukturen zeigten eine dichtere Packung der carboxy-terminalen Wiederholung zu der letzten internen Wiederholung. Dieses Verhalten erklärt die verbesserte thermische Stabilität des neuen Designs.

Abstract

Abstracts

My PhD thesis focuses on the structure analysis of proteins by X-ray crystallography, namely bacterial membrane proteins from the family of ABC transporters, the inflammasome adaptor protein SGT1 and Designed Ankyrin Repeat Proteins. These three topics will be summarized below.

Several ABC-transporters of Escherichia coli have been selected for recombinant expression and purification. By screening of several constructs and expression conditions the ABC-transporters YojI, MclB and HlyB were expressed. The purification protocol for the microcin exporter YojI was optimized and it was shown that YojI forms a stable dimer. This protein was used for functional assays. The obtained results form the basis for an increased understanding of the function of ABC-transporters.

The human protein SGT1 was expressed and characterized by biophysical methods. This protein is involved in the pathogen defence reactionin the mammalian immunesystem and its planhomologue is involved in the hypersensitivity response. Since the full length protein SGT1 did not yield crystals, we used limited proteolysis to obtain fragments that might be amendable for crystallization. Several fragments were obtained, cloned and overexpressed. For the central CS-domain an X-ray structures became available during my PhD thesis, for the N-terminal TPR domain structures of homologues were elucidated. The C-terminal SGS-domain revealed a limited degree of folding. The gained information is useful for further immuno-assays in order to determine interaction partners. Selected Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) were structurally analysed. DARPins are extremely stable repeat proteins having a vast field of application as inhibitors and as crystallization aids. Previous studies have shown that the C-terminal capping repeat is limiting the stablility of these molecules. Therefore the group of Prof. A. Plückthun designed new C-terminal caps that showed improved thermal stability. To analyse the structural determinants for this improved thermal stability the DARPins NI1C mutant 4, NI3C mutant 5 and NI3C mutant 6 were crystallized. The crystal structures revealed an improved packing between the C-terminal capping repeat and the last internal repeat explaining the improved thermal stabilityof the new design. Meine Dissertation beschäftigt sich mit der Röntgenstrukturanalyse von Proteinen. Zu diesen gehörten Mitglieder der Familie der ABC-transporter, das Inflammasome-Adapter- Protein SGT1 und den sogenannte Designed Ankyrin Repeat Proteins, welche folgend kurz beschrieben werden.

Eine Auswahl ABC-Transporter aus dem Organismus Escherichia coli wurde selektioniert, um eine einfache Expression zu gewährleisten. Bei dem Screening von verschiedenen Konstrukte und Expressionsbedingungen konnten die ABC-transporter YojI, MclB und HlyB expremiert werden. Es wurde gezeigt, dass der Microcin-exproter YojI ein stabiles Dimer bildet welcher für funktionelle Analysen genutzt wurde. Die hieraus hervorgegangenen Resultate werden eine Basis für das Verständnis der Funktion der ABC-Transporter von Nutzen sein.

Das humane Protein SGT1 wurde aufgereingt und durch biophysikalische Messmethoden charakterisiert. Dieses Protein ist in der Abwehrreaktion von Pathogenen in der Immunantwort des Säugetiers und sein pflanzliches Homolog in der so genannten Hypersensitivitätsreaktion beteiligt. Da das Protein SGT1 keine Kristalle bildete, wurden mit Hilfe von limitierten Proteolyseversuchen Fragmente bestimmt, welche die Kristallbildung vereinfachen sollen. Die dabei erhaltenen Fragmente wurden kloniert und aufgereinigt. Während dieser Arbeit wurde eine Struktur der mittleren CS-Untereinheit mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt, für die amino-terminale TPR-Untereinheit wurden Strukturen von Homologen bekannt. Die carboxy-terminale SGS-Unterinheit zeigte einen beschränkten Anteil an Faltung. Die erhaltenen Informationen können für die Ermittlung von Interaktionspartnern durch Immunoassays dienen.

Ausgewählte Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) wurden strukturbiologisch analysiert. DARPins sind extrem stabile Proteine welche aus sich wiederholenden Aminosäuresequenzen bestehen. Diese Proteine zeichnen sich durch eine weit gefächerte Anwendungsvielfalt aus, wie zum Beispiel ihr Nutzen als Inhibitoren und als Kristallisationshilfen. Vorangegangene Studien zeigten, dass die C-terminal Wiederholung die Stabilität dieser Moleküle limitiert. Deshalb entwarf die Gruppe von Prof. A. Plückthun diese C-terminale Wiederholung neu, ihre Resultate wiesen erhöhten thermischen Stabilitäten auf. Um die strukturellen Faktoren für diese verbesserte Stabilitäten zu bestimmen, wurden die DARPins NI1C mutant 4, NI3C mutant 5 and NI3C mutant 6 kristallisiert. Die Röntgenkristallstrukturen zeigten eine dichtere Packung der carboxy-terminalen Wiederholung zu der letzten internen Wiederholung. Dieses Verhalten erklärt die verbesserte thermische Stabilität des neuen Designs.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Grütter Markus G, Dutzler Raimund
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:14 Jan 2010 13:14
Last Modified:08 Feb 2019 14:56
Number of Pages:116
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod006290598&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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