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Alternative splicing of genes associated with retinitis pigmentosa - pathogenic mechanisms and therapeutic approaches


Tanner, Gaby-Gerda. Alternative splicing of genes associated with retinitis pigmentosa - pathogenic mechanisms and therapeutic approaches. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary Currently, about 70% of the human genes are expected to use alternative splicing to express multiple, sometimes tissue-specific, isoforms. Furthermore, it is well known that splicing can influence disease pathogeneses in three major ways: either by mutations that interfere with accurate splice site recognition or by mutations located in splice factors as well as in tissue- specifically expressed sequences. Retinitis pigmentosa (RP) is a degenerative retinopathy that causes severe visual impairments or even complete blindness in about 1.5 million patients worldwide. In contrast to other diseases, splicing is involved in the pathogenesis of RP through all three major ways. Nevertheless, the detailed pathogenic mechanism is not well understood and no approved treatment available to cure classical RP. In recent years, many novel therapeutic possibilities have been developed. However, also the best therapy is not effective, if the underlying mutation is not identified, the protein function not known or the pathogenic mechanism not fully understood. Therefore, this study investigated the impact of splicing on the pathogenesis of RP through the prediction of gene structures and mutational screening. Functional characterization of a novel mutation and an alternative exon as well as the development of a therapeutic strategy to treat splice site mutations in rhodopsin (RHO) complemented this study. Alternative isoform prediction was performed from bioinformatic EST database searches and expression of splice variants could be predicted for almost all RP-associated genes. This indicates that these genes undergo more often alternative splicing than other groups of genes. Expression of one novel exon in the splice factor PRPF3 could be confirmed in human and mouse retina. However, the question remains how mutations in widely expressed splice factors can result in retina-specific symptoms of RP. Therefore, the function of the novel exon has been analyzed and the inclusion of the novel exon has been found to introduce a premature termination codon which induces nonsense-mediated decay (NMD). Interestingly, expression of alternative, NMD-inducing exons in other splice factors has been shown to regulate the protein expression level of the own gene or of other splice factors and thus to control indirectly the splicing process. Furthermore, tissue-specific differences of NMD activity have been associated with disease pathogenesis. Together, this suggests that the novel exon in PRPF3 may have regulatory function involved in the pathogenesis of RP. A novel silent point mutation in RHO has been identified to change the last nucleotide of an exon and was predicted to impair accurate donor splice site usage. Comprehensive analysis in cell culture showed that the mutation severely disturbed exon recognition and induces the production of two aberrant transcripts. Manipulation of the spliceosome by modified U1 small nuclear ribonucleoproteins and inhibition of a competitive cryptic splice site could re-direct accurate splice site selection. Furthermore, this combinatory strategy has been shown to restore almost the same splice isoform ratio than observed in non mutated conditions. Our results indicate that this novel method provides a promising strategy for future therapeutic treatments. Since our approach is mutation-dependent, but disease-independent, it also represents a strategy to develop similar treatments in other disorders. Zusammenfassung Derzeit nutzen schätzungsweise 70% aller menschlichen Gene alternatives Spleissen, um mehrere, teilweise auch gewebespezifische, Proteinvarianten zu erzeugen. Ausserdem ist bekannt, dass die Pathogenese vieler Krankheiten von Mutationen ausgelöst wird, die drei Hauptursachen haben: entweder beeinflussen sie das Spleißen direkt negativ, oder betreffen Spleissfaktoren, oder kommen in gewebespezifisch gespleißten Sequenzen vor. Die erbliche Augenkrankheit Retinitis pigmentosa (RP), von der weltweit über 1.5 Millionen Patienten betroffen sind, führt von schweren visuellen Einschränkungen bis hin zu absoluter Blindheit. Im Gegensatz zu den meisten Krankheiten sind in RP alle drei Einflüsse des Spleissens auf die Pathogenese erwiesen. Trotzdem sind die Pathogenesemechanismen nicht vollständig aufgeklärt und noch keine Therapie erhältlich. In den letzten Jahren wurden viele neue Therapiemöglichkeiten entwickelt. Doch solange die krankheitsauslösende Mutation nicht identifiziert, die Proteinfunktion nicht bekannt oder die Pathogenese nicht verstanden ist, ist es schwierig neue und effiziente Therapieansätze zu entwickeln. Deshalb hat diese Studie versucht den Einfluss des Spleissens auf die Pathogenese von RP über die Bestimmung der Genstruktur, die Mutationssuche und über die Erforschung der Mutationskonsequenzen sowie der Proteinfunktion zu ergründen. Die Entwicklung einer viel versprechenden, therapeutischen Strategie zur Wiederherstellung einer mutierten Spleissstelle in Rhodopsin (RHO) vervollständigte diese Arbeit. Mittels einer bioinformatischen EST Datenbankanalyse wurden Varianten von RP assoziierten Genen vorausgesagt und für fast alle von ihnen konnten mehrere Isoformen gefunden werden. Das zeigt, dass diese Gene häufiger alternativem Spleissen zu unterliegen scheinen als andere Gene. Die Expression eines neuen Exons in dem Spleissfaktor PRPF3 konnte in der Retina vom Menschen und von Mäusen bestätigt werden. Da sich bei ubiquitär exprimierten Spleissfaktoren die Frage stellt, wie die Mutationen zu den retinaspezifischen Symptomen von RP führen können, wurde die Funktion des neuen Exons analysiert. Tatsächlich konnte bewiesen werden, dass die Expression des Exons zum Abbau des alternativen Transkripts führt. Interessanterweise kann die Expression von alternativen, Transkriptabbau vermittelnden Exonen in anderen Spleissfaktoren die eigene Proteinexpression und die anderer Spleissfaktoren kontrollieren, um damit den Spleissprozess zu regulieren. Zudem wurden gewebespezifische Unterschiede der Abbauaktivität mit Krankheiten assoziiert. Das lässt vermuten, dass das neue Exon des PRPF3s regulatorische Funktion in der Pathogenese von RP haben könnte. Eine neue Punktmutation in der letzten Base eines Exons von RHO könnte die Erkennung der Spleissstlelle negativ beeinflussen. Umfassende Charakterisierung zeigte tatsächlich, dass die Mutation die Exonerkennung erheblich stört, was zur Entstehung zweier Transkripte führt, die nicht funktionelle Proteine erzeugen würden. Die Manipulation des Spleisseosoms durch veränderte U1 Ribonukleinproteine und Hemmung einer konkurrierenden, kryptischen Spleissstelle konnte die korrekte Exonerkennung verbessern und annährend das gleiche Verhältnis der Spleissvarianten wie im nicht mutierten Zustand wiederherstellen. Unsere Resultate zeigen, dass diese Methode eine viel versprechende Strategie für zukünftige therapeutische Ansätze darstellt. Da unsere Methode von der Mutation, aber nicht von der zu behandelnden Krankheit abhängt, kann diese Strategie auch die Basis für die Entwicklung von Therapien für andere Krankheiten bilden.

Abstract

Summary Currently, about 70% of the human genes are expected to use alternative splicing to express multiple, sometimes tissue-specific, isoforms. Furthermore, it is well known that splicing can influence disease pathogeneses in three major ways: either by mutations that interfere with accurate splice site recognition or by mutations located in splice factors as well as in tissue- specifically expressed sequences. Retinitis pigmentosa (RP) is a degenerative retinopathy that causes severe visual impairments or even complete blindness in about 1.5 million patients worldwide. In contrast to other diseases, splicing is involved in the pathogenesis of RP through all three major ways. Nevertheless, the detailed pathogenic mechanism is not well understood and no approved treatment available to cure classical RP. In recent years, many novel therapeutic possibilities have been developed. However, also the best therapy is not effective, if the underlying mutation is not identified, the protein function not known or the pathogenic mechanism not fully understood. Therefore, this study investigated the impact of splicing on the pathogenesis of RP through the prediction of gene structures and mutational screening. Functional characterization of a novel mutation and an alternative exon as well as the development of a therapeutic strategy to treat splice site mutations in rhodopsin (RHO) complemented this study. Alternative isoform prediction was performed from bioinformatic EST database searches and expression of splice variants could be predicted for almost all RP-associated genes. This indicates that these genes undergo more often alternative splicing than other groups of genes. Expression of one novel exon in the splice factor PRPF3 could be confirmed in human and mouse retina. However, the question remains how mutations in widely expressed splice factors can result in retina-specific symptoms of RP. Therefore, the function of the novel exon has been analyzed and the inclusion of the novel exon has been found to introduce a premature termination codon which induces nonsense-mediated decay (NMD). Interestingly, expression of alternative, NMD-inducing exons in other splice factors has been shown to regulate the protein expression level of the own gene or of other splice factors and thus to control indirectly the splicing process. Furthermore, tissue-specific differences of NMD activity have been associated with disease pathogenesis. Together, this suggests that the novel exon in PRPF3 may have regulatory function involved in the pathogenesis of RP. A novel silent point mutation in RHO has been identified to change the last nucleotide of an exon and was predicted to impair accurate donor splice site usage. Comprehensive analysis in cell culture showed that the mutation severely disturbed exon recognition and induces the production of two aberrant transcripts. Manipulation of the spliceosome by modified U1 small nuclear ribonucleoproteins and inhibition of a competitive cryptic splice site could re-direct accurate splice site selection. Furthermore, this combinatory strategy has been shown to restore almost the same splice isoform ratio than observed in non mutated conditions. Our results indicate that this novel method provides a promising strategy for future therapeutic treatments. Since our approach is mutation-dependent, but disease-independent, it also represents a strategy to develop similar treatments in other disorders. Zusammenfassung Derzeit nutzen schätzungsweise 70% aller menschlichen Gene alternatives Spleissen, um mehrere, teilweise auch gewebespezifische, Proteinvarianten zu erzeugen. Ausserdem ist bekannt, dass die Pathogenese vieler Krankheiten von Mutationen ausgelöst wird, die drei Hauptursachen haben: entweder beeinflussen sie das Spleißen direkt negativ, oder betreffen Spleissfaktoren, oder kommen in gewebespezifisch gespleißten Sequenzen vor. Die erbliche Augenkrankheit Retinitis pigmentosa (RP), von der weltweit über 1.5 Millionen Patienten betroffen sind, führt von schweren visuellen Einschränkungen bis hin zu absoluter Blindheit. Im Gegensatz zu den meisten Krankheiten sind in RP alle drei Einflüsse des Spleissens auf die Pathogenese erwiesen. Trotzdem sind die Pathogenesemechanismen nicht vollständig aufgeklärt und noch keine Therapie erhältlich. In den letzten Jahren wurden viele neue Therapiemöglichkeiten entwickelt. Doch solange die krankheitsauslösende Mutation nicht identifiziert, die Proteinfunktion nicht bekannt oder die Pathogenese nicht verstanden ist, ist es schwierig neue und effiziente Therapieansätze zu entwickeln. Deshalb hat diese Studie versucht den Einfluss des Spleissens auf die Pathogenese von RP über die Bestimmung der Genstruktur, die Mutationssuche und über die Erforschung der Mutationskonsequenzen sowie der Proteinfunktion zu ergründen. Die Entwicklung einer viel versprechenden, therapeutischen Strategie zur Wiederherstellung einer mutierten Spleissstelle in Rhodopsin (RHO) vervollständigte diese Arbeit. Mittels einer bioinformatischen EST Datenbankanalyse wurden Varianten von RP assoziierten Genen vorausgesagt und für fast alle von ihnen konnten mehrere Isoformen gefunden werden. Das zeigt, dass diese Gene häufiger alternativem Spleissen zu unterliegen scheinen als andere Gene. Die Expression eines neuen Exons in dem Spleissfaktor PRPF3 konnte in der Retina vom Menschen und von Mäusen bestätigt werden. Da sich bei ubiquitär exprimierten Spleissfaktoren die Frage stellt, wie die Mutationen zu den retinaspezifischen Symptomen von RP führen können, wurde die Funktion des neuen Exons analysiert. Tatsächlich konnte bewiesen werden, dass die Expression des Exons zum Abbau des alternativen Transkripts führt. Interessanterweise kann die Expression von alternativen, Transkriptabbau vermittelnden Exonen in anderen Spleissfaktoren die eigene Proteinexpression und die anderer Spleissfaktoren kontrollieren, um damit den Spleissprozess zu regulieren. Zudem wurden gewebespezifische Unterschiede der Abbauaktivität mit Krankheiten assoziiert. Das lässt vermuten, dass das neue Exon des PRPF3s regulatorische Funktion in der Pathogenese von RP haben könnte. Eine neue Punktmutation in der letzten Base eines Exons von RHO könnte die Erkennung der Spleissstlelle negativ beeinflussen. Umfassende Charakterisierung zeigte tatsächlich, dass die Mutation die Exonerkennung erheblich stört, was zur Entstehung zweier Transkripte führt, die nicht funktionelle Proteine erzeugen würden. Die Manipulation des Spleisseosoms durch veränderte U1 Ribonukleinproteine und Hemmung einer konkurrierenden, kryptischen Spleissstelle konnte die korrekte Exonerkennung verbessern und annährend das gleiche Verhältnis der Spleissvarianten wie im nicht mutierten Zustand wiederherstellen. Unsere Resultate zeigen, dass diese Methode eine viel versprechende Strategie für zukünftige therapeutische Ansätze darstellt. Da unsere Methode von der Mutation, aber nicht von der zu behandelnden Krankheit abhängt, kann diese Strategie auch die Basis für die Entwicklung von Therapien für andere Krankheiten bilden.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Berger Wolfgang, Neuhauss Stephan
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:24 Feb 2010 14:58
Last Modified:24 Sep 2019 16:35
Number of Pages:174
Additional Information:Alternative splicing of genes associated with retinitis pigmentosa - pathogenic mechanisms and therapeutic approaches / vorgelegt von Gaby-Gerda Tanner. - Zürich, 2010
OA Status:Green
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