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Alpha-cleavage of the prion protein and the putative function of the prion protein in lymphocyte homeostasis


Martins, José Barros Oliveira. Alpha-cleavage of the prion protein and the putative function of the prion protein in lymphocyte homeostasis. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary

Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders that have the particularity of being caused by an infectious proteinaceous agent. The main player in this disease is a structural modification of the endogenous non-pathogenic prion protein (PrPC), termed PrPSc. Though PrPC is widely expressed in the body and highly conserved in mammals, its physiological function remains elusive. Moreover, Prnp-/- mice devoid of PrP have no strong evident phenotype, apart from being completely resistant to prion diseases. Interestingly, many PrPC mutants with deletions around the α-cleavage site of PrPC are highly toxic when expressed in transgenic mice and this toxicity is rescued by coexpression of wild-type PrPC. One of the main mysteries in the prion field is the elucidation of the molecular mechanisms that drive not only the toxicity of PrPSc, but also the pathology caused by these PrPC deletion mutants. To understand the principles behind PrP-dependent toxicity, first a model was conceptualized, which aimed to integrate and unify the largest possible set of experimental evidences already available in the literature. The goal was to conceive a framework that congregates a putative function of PrPC, as well as the pathological features of prion diseases and of prionopathies caused by PrPC deletion mutants. From all possible models considered, the most parsimonic one established that α- cleavage of the PrPC central domain is crucial for regulating PrPC function and for explaining PrP-dependent toxicity. The model was also based on a main set of assumptions, which are that internalization of uncleaved PrPC contributes to cell activation, and that miss-regulation of this process results in cell over-activation and consequent cell death. Therefore, I decided to study these two paradigms, which are the α-cleavage, and the toxicity due to the putative cell hyper-activation derived from PrPC miss-regulation. Concerning α-cleavage, the main grounds sustaining its importance are that both PrPSc and all toxic PrPC deletion mutants have a strong impairment on α-cleavage. In this project I tried to identify the PrPC domains neighbouring the α-cleavage site, which play a role in mediating this proteolysis. Assessment of the α-cleavage rate of a large number of PrPC mutants designed in this study revealed that neither substitution of the amino-acid residues at the cleavage site, replacement or inversion of the charged residues, mutation of the palindromic region, nor exchange of the

4 hydrophobic amino-acids, had major effects on the degree of α-cleavage. Also, short deletions at the cleavage site had only a mild effect on PrPC proteolysis. However, an increase in the size of the deletion resulted in a gradual decrease of α-cleavage rate, which was virtually blocked in the deletion mutant PrPΔ(106-119). These results suggest that cleavage of PrPC is largely sequence independent, which is an uncommon feature that can find parallelism with the proteolytic plasticity of the γ-secretase. To investigate the second paradigm, that PrPC is a modulator of cell activation, and that miss-regulation of its function can result in cell death, the impact of PrPC on lymphocyte activation and positive and negative selection of lymphocytes was assessed. This study suggested that PrPC is strongly up-regulated in activated T- cells, and that it is found at high quantities in activated lymphocytes, in cells undergoing positive selection, and in populations that traditionally have high reactivity to antigens, like regulatory T-cells and marginal zone B-cells. An alteration of the lymphocytic homeostasis in mice deficient of or overexpressing PrPC was also observed. This alteration could be explained by a deletion of the transgenic cells with high levels of PrPC during the negative selection of auto-reactive cells, and by an arrest in development due to anergy of Prnp-/- lymphocytes. In addition, it was shown that the costimulatory CD3 molecule is down-regulated in circulating T-cells from PrPC-overexpressing mice, probably in order to re-establish the activation threshold, which might have been decreased due to the high presence of PrPC. Finally, I showed that PrPC overexpression partially rescues the impairment on development of CD4 T-cells in mice devoid of MHC class II, which is essential for providing an activatory signal to these cells. Taken together, here I propose a unifying model for PrP function and PrP- dependent toxicity, assessed the main assumption, and studied the principles governing α-cleavage, which is the main mechanism of this model.



5 Prionenkrankungen sind fatale neurodegenerative Erkrankungen, deren Besonderheit es ist, ein infektiöses Protein als Ursache zu haben. Der Hauptverursacher dieser Erkrankung ist eine strukturell missgefaltete Version des endogenen, nicht-pathogenen Prionenproteins (PrPC), genannt PrPSc. Obwohl PrPC praktisch im gesamten Organismus vorkommt und die Sequenz in Säugetieren stark konserviert ist, blieb die Frage der physiologischen Funktion bisher ungelöst. Überdies haben Prnp-/- Mäuse ohne das Prion-Protein keinen stark ausgeprägten Phänotyp - ausser dass sie komplett resistent gegen Prionen-Erkrankung sind. Interessanterweise sind viele PrP-Mutationen mit einer Deletion in der Nähe der - Schnittstelle von PrPC extrem toxisch, wenn sie in transgenen Mäusen exprimiert werden. Diese Toxizität wird aber bei gleichzeitiger Expression von PrPC aufgehoben. Eines der grossen Mysterien im Bereich der Prionen bleibt die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die der Toxizität von PrPSc wie auch der Deletionsmutanten von PrPC zugrunde liegen. Um die Prinzipien, die hinter der PrP-abhängigen Toxizität stehen, zu beleuchten, entwarf ich ein Modell, das möglichst viele bereits publizierter experimenteller Beweise integriert. Das Ziel war ein Model, der sowohl die mögliche Funktion von PrPC, wie auch die pathologischen Charakteristika von übertragbarer Prionenerkrankungen und der Deletionsmutanten erklärt. Das plausibelste Model wäre, dass die -Schnittstelle in der zentralen Domäne des Prion-Proteins essentiell für die Funktion des Proteins ist. Die Konsequenz wäre, dass eine Fehl-Regulation der proteolytischen Spaltung eine konstante Internalisation von aktivem PrP zur Folge hat, was eine Erhöhung des Aktivierungsstatus der Zelle hat und schlussendlich den Zelltod auslöst. Daraufhin beschloss ich, die Spaltung an der α- Schnittstelle und die Toxizität, die möglicherweise von der Hyperaktivierung, aufgrund einer PrPC-Fehlregulation verursacht wird, zu untersuchen. Dass die -Spaltung tatsächlich äusserst wichtig ist, wird dadurch unterstützt, dass sowohl PrPSc, als auch alle toxischen PrPC Mutanten eine ausgeprägte Beeinträchtigung der -Spaltung aufweisen. Mein Ziel war die Identifikation von PrPC Domänen, die die -Spaltung ermöglichen, und ihre Charakteristika zu determinieren. Ich habe deswegen eine Vielzahl von PrPC Mutanten kreiert und ihre 6 proteolytische Aktivität analysiert. Weder die Substitution von Aminosäurenresten an der Schnittstelle, der Austausch oder die Ladungsumkehr von basischen Aminosäuren, Mutation der palindromischen Region oder der Austausch der hydrophobischen Aminosäuren hatten einen grossen Einfluss auf die Spaltung. Auch kleinere Deletionen um die Spaltungstelle resultierten in geringer Beeinträchtigung des Spaltunsprozesses. Das Entfernen grösserer Bereiche hingegen reduzierte die -Spaltungsrate. Im Falle der Deletionsmutante PrPΔ(106-119) tratt praktisch keine Spaltung mehr auf. Daraus schliesse ich, dass die Spaltung von PrPC grösstenteils sequenzunabhängig ist, was mit der proteolytischen Aktivität der -Sekretase verglichen werden kann. Um das zweite Paradigma, PrPC als Modulator der Zellaktivität, beziehungsweise die Fehlregulation seiner Funktion die zum Zelltod führen kann, zu studieren, habe ich die Entwicklung von Lymphozyten untersucht. Ich analysierte die Expression von PrPC während der Lymphocyten-Aktivierung, und der positiven und negativen Selektion von Lymphozyten. Dabei stellte ich eine starke Hochregulation von PrPC in aktivierten T Zellen fest. Ausserdem konnte ich erhöhte PrP-Werte auf aktivierten Lymphozyten, und während der positiven Selektion, und in reaktiven Populationen wie zum Beispiel regulatorischen T Zellen oder B Zellen der Marginalzone nachweisen. Bei der Analyse von Prnp-/- und PrP überexprimierenden Mäusen, konnte ich Veränderungen in der Homeostase der Lymphozytenpopulationen feststellen. Ein Grund dafür könnte die Deletion von Zellen mit übermässiger PrPC Expression, während der negativen Selektion von autoreaktiven Zellen, sein. Prnp-/- Lymphozyten hingegen reifen aufgrund von Aktivitätsmangel nicht vollständig. Ausserdem konnte ich zeigen, dass das Co-Stimulationsmolekül CD3 in C zirkulierenden T Zellen von PrP überexprimierenden Mäusen runterreguliert wird, möglicherweise um einen ausgeglichenen Aktivitätszustand der Zelle herstellen zu können, welcher durch die grosse Menge an PrPC reduziert ist. Schliesslich konnte ich zeigen, dass die Überexpression von PrPC partiell die Beeinträchtigung der Entwicklung von CD4 positiven T Zellen verbessern kann. Dafür analysierte ich MHC class II defiziente Mäuse. MHC class II ist wichtig für die Zellaktivierung während der Entwicklung. MHC II defizienten Mäusen fehlen daher CD4 positive Zellen. Zusammenfassend haben ich hiermit ein Modell entwickelt, das PrP-Funktion und PrP-induzierte Toxizität miteinander vereint, konnte dessen Grundannahmen



7 bestätigen, und die -Spaltung eingehend charakterisieren, welche laut unserer Hypothese der Hauptmechanismus ist.



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Abstract

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Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders that have the particularity of being caused by an infectious proteinaceous agent. The main player in this disease is a structural modification of the endogenous non-pathogenic prion protein (PrPC), termed PrPSc. Though PrPC is widely expressed in the body and highly conserved in mammals, its physiological function remains elusive. Moreover, Prnp-/- mice devoid of PrP have no strong evident phenotype, apart from being completely resistant to prion diseases. Interestingly, many PrPC mutants with deletions around the α-cleavage site of PrPC are highly toxic when expressed in transgenic mice and this toxicity is rescued by coexpression of wild-type PrPC. One of the main mysteries in the prion field is the elucidation of the molecular mechanisms that drive not only the toxicity of PrPSc, but also the pathology caused by these PrPC deletion mutants. To understand the principles behind PrP-dependent toxicity, first a model was conceptualized, which aimed to integrate and unify the largest possible set of experimental evidences already available in the literature. The goal was to conceive a framework that congregates a putative function of PrPC, as well as the pathological features of prion diseases and of prionopathies caused by PrPC deletion mutants. From all possible models considered, the most parsimonic one established that α- cleavage of the PrPC central domain is crucial for regulating PrPC function and for explaining PrP-dependent toxicity. The model was also based on a main set of assumptions, which are that internalization of uncleaved PrPC contributes to cell activation, and that miss-regulation of this process results in cell over-activation and consequent cell death. Therefore, I decided to study these two paradigms, which are the α-cleavage, and the toxicity due to the putative cell hyper-activation derived from PrPC miss-regulation. Concerning α-cleavage, the main grounds sustaining its importance are that both PrPSc and all toxic PrPC deletion mutants have a strong impairment on α-cleavage. In this project I tried to identify the PrPC domains neighbouring the α-cleavage site, which play a role in mediating this proteolysis. Assessment of the α-cleavage rate of a large number of PrPC mutants designed in this study revealed that neither substitution of the amino-acid residues at the cleavage site, replacement or inversion of the charged residues, mutation of the palindromic region, nor exchange of the

4 hydrophobic amino-acids, had major effects on the degree of α-cleavage. Also, short deletions at the cleavage site had only a mild effect on PrPC proteolysis. However, an increase in the size of the deletion resulted in a gradual decrease of α-cleavage rate, which was virtually blocked in the deletion mutant PrPΔ(106-119). These results suggest that cleavage of PrPC is largely sequence independent, which is an uncommon feature that can find parallelism with the proteolytic plasticity of the γ-secretase. To investigate the second paradigm, that PrPC is a modulator of cell activation, and that miss-regulation of its function can result in cell death, the impact of PrPC on lymphocyte activation and positive and negative selection of lymphocytes was assessed. This study suggested that PrPC is strongly up-regulated in activated T- cells, and that it is found at high quantities in activated lymphocytes, in cells undergoing positive selection, and in populations that traditionally have high reactivity to antigens, like regulatory T-cells and marginal zone B-cells. An alteration of the lymphocytic homeostasis in mice deficient of or overexpressing PrPC was also observed. This alteration could be explained by a deletion of the transgenic cells with high levels of PrPC during the negative selection of auto-reactive cells, and by an arrest in development due to anergy of Prnp-/- lymphocytes. In addition, it was shown that the costimulatory CD3 molecule is down-regulated in circulating T-cells from PrPC-overexpressing mice, probably in order to re-establish the activation threshold, which might have been decreased due to the high presence of PrPC. Finally, I showed that PrPC overexpression partially rescues the impairment on development of CD4 T-cells in mice devoid of MHC class II, which is essential for providing an activatory signal to these cells. Taken together, here I propose a unifying model for PrP function and PrP- dependent toxicity, assessed the main assumption, and studied the principles governing α-cleavage, which is the main mechanism of this model.



5 Prionenkrankungen sind fatale neurodegenerative Erkrankungen, deren Besonderheit es ist, ein infektiöses Protein als Ursache zu haben. Der Hauptverursacher dieser Erkrankung ist eine strukturell missgefaltete Version des endogenen, nicht-pathogenen Prionenproteins (PrPC), genannt PrPSc. Obwohl PrPC praktisch im gesamten Organismus vorkommt und die Sequenz in Säugetieren stark konserviert ist, blieb die Frage der physiologischen Funktion bisher ungelöst. Überdies haben Prnp-/- Mäuse ohne das Prion-Protein keinen stark ausgeprägten Phänotyp - ausser dass sie komplett resistent gegen Prionen-Erkrankung sind. Interessanterweise sind viele PrP-Mutationen mit einer Deletion in der Nähe der - Schnittstelle von PrPC extrem toxisch, wenn sie in transgenen Mäusen exprimiert werden. Diese Toxizität wird aber bei gleichzeitiger Expression von PrPC aufgehoben. Eines der grossen Mysterien im Bereich der Prionen bleibt die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die der Toxizität von PrPSc wie auch der Deletionsmutanten von PrPC zugrunde liegen. Um die Prinzipien, die hinter der PrP-abhängigen Toxizität stehen, zu beleuchten, entwarf ich ein Modell, das möglichst viele bereits publizierter experimenteller Beweise integriert. Das Ziel war ein Model, der sowohl die mögliche Funktion von PrPC, wie auch die pathologischen Charakteristika von übertragbarer Prionenerkrankungen und der Deletionsmutanten erklärt. Das plausibelste Model wäre, dass die -Schnittstelle in der zentralen Domäne des Prion-Proteins essentiell für die Funktion des Proteins ist. Die Konsequenz wäre, dass eine Fehl-Regulation der proteolytischen Spaltung eine konstante Internalisation von aktivem PrP zur Folge hat, was eine Erhöhung des Aktivierungsstatus der Zelle hat und schlussendlich den Zelltod auslöst. Daraufhin beschloss ich, die Spaltung an der α- Schnittstelle und die Toxizität, die möglicherweise von der Hyperaktivierung, aufgrund einer PrPC-Fehlregulation verursacht wird, zu untersuchen. Dass die -Spaltung tatsächlich äusserst wichtig ist, wird dadurch unterstützt, dass sowohl PrPSc, als auch alle toxischen PrPC Mutanten eine ausgeprägte Beeinträchtigung der -Spaltung aufweisen. Mein Ziel war die Identifikation von PrPC Domänen, die die -Spaltung ermöglichen, und ihre Charakteristika zu determinieren. Ich habe deswegen eine Vielzahl von PrPC Mutanten kreiert und ihre 6 proteolytische Aktivität analysiert. Weder die Substitution von Aminosäurenresten an der Schnittstelle, der Austausch oder die Ladungsumkehr von basischen Aminosäuren, Mutation der palindromischen Region oder der Austausch der hydrophobischen Aminosäuren hatten einen grossen Einfluss auf die Spaltung. Auch kleinere Deletionen um die Spaltungstelle resultierten in geringer Beeinträchtigung des Spaltunsprozesses. Das Entfernen grösserer Bereiche hingegen reduzierte die -Spaltungsrate. Im Falle der Deletionsmutante PrPΔ(106-119) tratt praktisch keine Spaltung mehr auf. Daraus schliesse ich, dass die Spaltung von PrPC grösstenteils sequenzunabhängig ist, was mit der proteolytischen Aktivität der -Sekretase verglichen werden kann. Um das zweite Paradigma, PrPC als Modulator der Zellaktivität, beziehungsweise die Fehlregulation seiner Funktion die zum Zelltod führen kann, zu studieren, habe ich die Entwicklung von Lymphozyten untersucht. Ich analysierte die Expression von PrPC während der Lymphocyten-Aktivierung, und der positiven und negativen Selektion von Lymphozyten. Dabei stellte ich eine starke Hochregulation von PrPC in aktivierten T Zellen fest. Ausserdem konnte ich erhöhte PrP-Werte auf aktivierten Lymphozyten, und während der positiven Selektion, und in reaktiven Populationen wie zum Beispiel regulatorischen T Zellen oder B Zellen der Marginalzone nachweisen. Bei der Analyse von Prnp-/- und PrP überexprimierenden Mäusen, konnte ich Veränderungen in der Homeostase der Lymphozytenpopulationen feststellen. Ein Grund dafür könnte die Deletion von Zellen mit übermässiger PrPC Expression, während der negativen Selektion von autoreaktiven Zellen, sein. Prnp-/- Lymphozyten hingegen reifen aufgrund von Aktivitätsmangel nicht vollständig. Ausserdem konnte ich zeigen, dass das Co-Stimulationsmolekül CD3 in C zirkulierenden T Zellen von PrP überexprimierenden Mäusen runterreguliert wird, möglicherweise um einen ausgeglichenen Aktivitätszustand der Zelle herstellen zu können, welcher durch die grosse Menge an PrPC reduziert ist. Schliesslich konnte ich zeigen, dass die Überexpression von PrPC partiell die Beeinträchtigung der Entwicklung von CD4 positiven T Zellen verbessern kann. Dafür analysierte ich MHC class II defiziente Mäuse. MHC class II ist wichtig für die Zellaktivierung während der Entwicklung. MHC II defizienten Mäusen fehlen daher CD4 positive Zellen. Zusammenfassend haben ich hiermit ein Modell entwickelt, das PrP-Funktion und PrP-induzierte Toxizität miteinander vereint, konnte dessen Grundannahmen



7 bestätigen, und die -Spaltung eingehend charakterisieren, welche laut unserer Hypothese der Hauptmechanismus ist.



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Aguzzi Adriano
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:05 Feb 2010 15:39
Last Modified:24 Sep 2019 16:36
Number of Pages:111
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005928153&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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