Identification of novel components in the DNA damage response pathways of Caenorhabditis elegans

Abstract

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Summary

Highly sophisticated DNA damage response pathways have evolved to ensure the maintenance of genomic stability. Errors in those pathways have dire consequences for the cell and lead to the accumulation of mutations in the genome, which is a hallmark of tumour cells. Thus, it is of high biological as well as medical interest to better understand the underlying principles and components of these pathways.

In this study, I used the small nematode Caenorhabditis elegans as a model or- ganism to identify novel components of the DNA damage response pathways. In a forward genetic screen, I isolated seventeen mutants that are hypersen- sitive to X-radiation. The strongest defect was observed in op444, which I characterized further. op444 displays F1 embryonic lethality upon ionizing irradiation and UV-C treatment. In response to DNA damage, op444 ini- tiate cell cycle arrest, apoptosis, and double-strand break repair. Embryos, however, die upon irradiation with defects in chromatin integrity, such as anaphase-bridged chromatin and extranuclear DNA fragments. I found that op444 maps to lem-3 (LAP2-emerin-MAN1 domain protein 3), which has not been previously characterized. By expression of a wild-type copy of the gene, I could fully rescue the radiation-sensitvity of lem-3(op444). I also found that rad-1(mn155), whose molecular identity has been unknown so far, is allelic to lem-3(op444). LEM-3 belongs to the GIY-YIG superfamily of nucleases, which have been implicated in recombination and repair.

This work provides the first evidence that LEM-3 acts in processes required to maintain genomic integrity. According to its domain structure, LEM-3 is a putative endonuclease and may be involved in a repair pathway specifically 5

required in the C. elegans embryo. As LEM-3 has been highly conserved throughout evolution, it might also be important to ensure genetic stability in higher organisms. 6

Eine präzise Weitergabe der genetischen Information ist evolutionär von großer Bedeutung. Zellen verfügen über komplexe Mechanismen, die der Weiter- gabe von Mutationen entgegenwirken. Sind diese Sicherheitsmechanismen jedoch gestört, akkumuliert die Zelle Mutationen in ihrem Genom und kann sich sogar zu einer Tumorzelle entwickeln. Diese für den Organismus fatalen Auswirkungen zeigen, dass die Erforschung dieser Mechanismen sowohl aus biologischer als auch aus medizinischer Sicht von großer Relevanz ist.

Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich besonders gut für große genetische Studien. In einer solchen habe ich nach Mutanten gesucht, die Fehler in diesen Sicherheitsmechanismen aufweisen. Dadurch sind ihre Nachkommen nicht mehr vor den Schäden durch Bestrahlung geschützt und sterben. Ich habe insgesamt siebzehn Mutanten isoliert, deren Nachkom- men nach DNA Schädigung durch Röntgenstrahlen eine eingeschränkte Über- lebensfähigkeit aufweisen. Die Mutante op444 reagiert besonders sensitiv auf Röntgenstrahlung und auf UV-C induzierte Schäden. Einige dieser Sicher- heitsmechanismen sind in op444 immer noch funktionell, im Embryo hinge- gen entstehen während der Zellteilung defekte Chromatinstrukturen und DNA Fragmente. Durch weitere Experimente habe ich herausgefunden, dass dieser Defekt durch eine Mutation in lem-3 (LAP2-emerin-MAN1 domain protein 3) bewirkt wird. Durch die Expression einer intakten Kopie des Gens konnte ich den Defekt reversieren. Ich habe außerdem gefunden, dass die vor langer Zeit isolierte, ähnliche Mutante rad-1 auch eine Mutation in lem-3 trägt. LEM-3 gehört zu einer Gruppe von Proteinen, die man GIY-YIG Nukleasen nennt. Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle während der DNA Rekombination 7

und Reparatur.

In dieser Arbeit habe ich gezeigt, dass LEM-3 in C. elegans eine wichtige Rolle spielt, um die genetische Information auch nach Bestrahlung noch korrekt weiterzugeben. Meiner Hypothese nach ist LEM-3 eine Endonuklease, deren Aufgabe es ist, spezielle abnormale Strukturen aus der DNA zu entfernen. Dadurch schützt LEM-3 die DNA vor Mutationen. Da die LEM-3 Sequenz evolutionär konserviert ist, wäre es möglich, dass LEM-3 auch in höheren Organismen eine ähnlich wichtige Rolle spielt.