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Transcriptional regulation and functions of the Drosophila paired gene


Kalvakuri, Sreehari. Transcriptional regulation and functions of the Drosophila paired gene. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary

The paired (prd) gene as well as the gooseberry (gsb) and gooseberry neuro (gsbn) genes of Drosophila are the founding members of the Pax gene family and part of the Pax-3/7 subfamily. As shown previously in this lab, prd encodes a transcription factor containing two DNA binding domains, a paired-domain and an extended prd- type homeodomain, in its N-terminal half and a 21-amino acid His-Pro or PRD repeat near its C-terminus, which serves as the major activation domain. Although prd, gsb, gsbn, and Pax3 have divergent C-terminal sequences and exhibit distinct functions, they share highly conserved DNA binding domains in the N-terminal half and are probably evolved by gene duplication from the same ancestral gene. In combination with other pair-rule genes, prd specifies the positional information along the antero- posterior axis and activates the segment polarity genes, including gsb, wingless, and engrailed. In addition to its embryonic segmentation function, prd is necessary for post-embryonic viability and male fertility. Two Prd homologs, the Drosophila Gsb and murine Pax3 proteins are able to substitute for some of the Prd functions when they are placed under the control of the complete cis-regulatory region of prd, which demonstrates that the cis-regulatory elements play a dominant role during evolution.

In this study, we investigated the cis-regulatory elements of prd in great detail, using a series of partial rescue transgenes and reporter transgenes. The results show that there are at least three enhancer regions in the prd locus, which can produce a striped pattern independent of each other. Our previous results showed that multiple cis-regulatory elements in the upstream region produce a striped pattern in the embryo. Here, we could demonstrate that the downstream region and intron sequences also produce a striped pattern. Rescue experiments with transgenes affording partial rescue uncovered the haplo-insufficiency of upstream enhancers for survival and adult cuticle functions of prd. This haplo-insufficiency of upstream enhancers is rescued completely by a single copy of a prd transgene under the sole control of the downstream enhancers. Investigation of these enhancers in detail uncovered a partial redundancy in the downstream control region required for survival and adult cuticle functions of prd.



1 Investigation of the male fertility function has previously revealed that prd is necessary for the development of accessory glands by promoting cell division and for the transcriptional regulation of genes essential for the function of the accessory glands. Downstream sequences of prd are necessary for the development of accessory glands. Here, we show that the upstream sequences also control prd expression in the adult accessory glands. The enhancer responsible for prd expression in the accessory glands has been mapped to a 590 bp fragment in the upstream region and shown to be crucial for the male fertility function. Interestingly, prd mutants rescued by a transgene, regulated by the entire upstream region but lacking the accessory gland enhancer, and by a transgene under control of the downstream region of prd develop accessory glands, but the glands are small in size and show reduced expression of Prd in freshly eclosed males. These glands gradually go through morphological changes that end with the complete collapse of the gland’s lumen while Prd protein levels are strongly elevated in virgin males older than 5 days. This persistent and strong expression of Prd might result from a failure in feedback regulation that is observed in the accessory glands of wild-type virgin males: prd transcription in accessory glands is repressed when the gland’s lumen is filled with secretory proteins, and this repression is relieved when the gland's content is emptied during mating.

Our earlier results suggest that prd is required for proper segmentation of the adult abdomen. Conditional knockout of prd in this study corroborated a crucial role of prd in adult cuticle segmentation. The enhancer partly responsible for the adult segmentation function has been identified in the downstream region of prd. It functions in the histoblasts to control the development of abdominal segments. This is evident from experiments demonstrating that the removal of prd function in the histoblasts is sufficient to produce the adult segmentation phenotype. Finally, we could identify the enhancers that control prd expression in the dorsal spot of embryos, in the ventral gustatory organ of the larvae, and in the trochanter segment of the legs.

In summary, several novel enhancers for newly discovered functions and/or expression patterns were characterized, more than initially expected.



2 Zusammenfassung Das paired (prd) Gen sowie die beiden Gene gooseberry (gsb) und gooseberry neuro (gsbn) von Drosophila sind die Gründungsmitglieder der Pax-Gen-Familie und ein Teil der Pax-3/7 Unterfamilie. Wie früher in diesem Labor gezeigt wurde, kodiert prd für einen Transkriptionsfaktor mit zwei DNA-bindenden Domänen, einer Paireddomäne und einer erweiterten Homeodomäne vom prd-Typ, in seiner N- terminalen Hälfte und gegen das C-terminale Ende mit einem 21 Aminosäure langen His-Pro oder PRD Repeat, der als starke Aktivierungsdomäne dient. Obwohl prd, gsb, gsbn und Pax3 unterschiedliche C-terminale Sequenzen und verschiedene Funktionen haben, besitzen sie hochkonservierte DNA-bindende Domänen in der N-terminalen Hälfte und entwickelten sich wahrscheinlich durch Gen-Duplikation aus dem gleichen Urgen. Zusammen mit anderen Paarregelgenen wirkt prd im Embryo bei der Etablierung der Position auf der von vorne nach hinten verlaufenden Achse mit, indem es die Transkription von Segment-Polaritätsgenen, einschliesslich gsb, wingless und engrailed aktiviert. Zusätzlich zu dieser Funktion während der embryonalen Segmentierung ist prd wichtig für die post-embryonale Entwicklung und für die Fruchtbarkeit von Männchen. Die schon erwähnten homologen Proteine, Gsb von Drosophila und Pax3 der Maus, sind in der Lage einige dieser Funktionen von prd auszuüben, wenn sie unter der Kontrolle der vollständigen cis-regulatorischen Region des prd Gens stehen. Daraus lässt sich schliessen, dass die cis-regulatorischen Elemente eine dominante Rolle während der Evolution spielen.

In dieser Forschungsarbeit analysierten wir die cis-regulatorischen Elemente von prd im Detail anhand einer Reihe von prd-Transgenen, welche die prd Mutanten nur partiell retten können und von prd-Reportergenen, die nur einen Teil der Expression von prd zeigen. Die Ergebnisse zeigen, dass es mindestens drei „Enhancer“-Regionen im prd Lokus gibt, die unabhängig von einander ein Streifen- Muster im Embryo bilden können. Unsere früheren Ergebnisse zeigten, dass mehrere cis-regulatorische Elemente, die vor dem prd Gen liegen, ein Streifen-Muster bilden können. Zu unserer Überraschung fanden wir jetzt, dass sowohl das Intron des prd Gens wie auch die Region hinter dem Gen dies unabhängig auch können. Nicht nur für das Expressionsmuster sondern auch für die Segmentierungsfunktion zeigen diese drei prd Enhancerregionen eine teilweise Redundanz. Die Haploinsuffizienz der



3 ‘upstream’-Enhancer von prd für das postembryonale Überleben und die Segmentierung im adulten Abdomen wurde mit prd-Transgenen gezeigt, welche die prd Mutanten nur teilweise retten. Diese Haploinsuffizienz der ‘upstream’-Enhancer kann durch nur ein einziges prd-Transgen unter der ausschliesslichen Kontrolle von ‘downstream’-Enhancern vollständig gerettet werden.

Die Untersuchung der Funktion von prd für die Fruchtbarkeit der Männchen hat früher ergeben, dass prd für die Entwicklung der akzessorischen Geschlechtsdrüse, die der Prostata von Säugetieren entspricht, unverzichtbar ist, da es dort die Zellteilung fördert und wichtige Gene für die Funktion der Drüse reguliert. Dabei wurde auch gezeigt, dass ‘downstream’-Sequenzen von prd für die Entwicklung der akzessorischen Geschlechtsdrüse unentbehrlich sind. Zu unserer Überraschung sind jedoch auch die ‘upstream’-Sequenzen wichtig für die korrekte Expression von prd in akzessorischen Geschlechtsdrüsen und dadurch für die Fruchtbarkeit der erwachsenen Männchen. Frisch geschlüpfte Männchen, die ohne den veranwortlichen 590-bp grossen ‘upstream’-Enhancer gerettet wurden, haben kleinere akzessorische Geschlechtsdrüsen mit verminderter Expression von prd. Mit dem Alter bricht das Lumen der Drüse vollständig zusammen und prd wird dann sogar stark überexprimiert. In der missgebildeten Drüse kommt diese Überexpression möglicherweise durch diesselbe Rückkoppelungs-Regulation zustande, die in der gesunden Drüse durch die Entleerung der Drüse während der Kopulierung beobachtet wurde. Denn prd wird in zölibatär gehaltenen Männchen fast vollständig reprimiert, höchstwahrscheinlich weil die Drüse gefüllt bleibt und kein Nachschub an sekretorischen Proteinen nötig ist. Erst die Entleerung der Drüse während der Kopulation führt zur Reaktivierung der prd Transkription.

Aufgrund von Experimenten, die in diesem Labor durchgeführt wurden, bestand der Verdacht, dass prd auch für die ordnungsgemäße Segmentierung während der Entwicklung des erwachsenen Abdomens sorgt. Die vollständig fusionierten abdominalen Segmente von Fliegen, bei denen fast alle postembryonale prd- Expression ausgeschaltet wurde, lassen jetzt keine Zweifel mehr offen. Der dafür teilweise verantwortliche Enhancer wurde hinter dem Gen identifiziert und funktioniert in Histoblasten während des Puppenstadiums, was gezeigt werden konnte, als prd nur in diesen Zellen ausgeschaltet wurde. Schliesslich konnten wir die

4 Enhancers identifizieren, welche die prd-Expression im dorsalen Fleck der Embryos, im ventralen Geschmacksorgan der Larven und im Trochanter-Segment der Beine der Puppen und erwachenen Fliegen steuern.

Zusammenfassend wurde eine Vielzahl von definierbaren Enhancern für neu entdeckte Funktionen und/oder Expressionsmuster von prd nachgewiesen, mehr als anfänglich erwartet.



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Abstract

Summary

The paired (prd) gene as well as the gooseberry (gsb) and gooseberry neuro (gsbn) genes of Drosophila are the founding members of the Pax gene family and part of the Pax-3/7 subfamily. As shown previously in this lab, prd encodes a transcription factor containing two DNA binding domains, a paired-domain and an extended prd- type homeodomain, in its N-terminal half and a 21-amino acid His-Pro or PRD repeat near its C-terminus, which serves as the major activation domain. Although prd, gsb, gsbn, and Pax3 have divergent C-terminal sequences and exhibit distinct functions, they share highly conserved DNA binding domains in the N-terminal half and are probably evolved by gene duplication from the same ancestral gene. In combination with other pair-rule genes, prd specifies the positional information along the antero- posterior axis and activates the segment polarity genes, including gsb, wingless, and engrailed. In addition to its embryonic segmentation function, prd is necessary for post-embryonic viability and male fertility. Two Prd homologs, the Drosophila Gsb and murine Pax3 proteins are able to substitute for some of the Prd functions when they are placed under the control of the complete cis-regulatory region of prd, which demonstrates that the cis-regulatory elements play a dominant role during evolution.

In this study, we investigated the cis-regulatory elements of prd in great detail, using a series of partial rescue transgenes and reporter transgenes. The results show that there are at least three enhancer regions in the prd locus, which can produce a striped pattern independent of each other. Our previous results showed that multiple cis-regulatory elements in the upstream region produce a striped pattern in the embryo. Here, we could demonstrate that the downstream region and intron sequences also produce a striped pattern. Rescue experiments with transgenes affording partial rescue uncovered the haplo-insufficiency of upstream enhancers for survival and adult cuticle functions of prd. This haplo-insufficiency of upstream enhancers is rescued completely by a single copy of a prd transgene under the sole control of the downstream enhancers. Investigation of these enhancers in detail uncovered a partial redundancy in the downstream control region required for survival and adult cuticle functions of prd.



1 Investigation of the male fertility function has previously revealed that prd is necessary for the development of accessory glands by promoting cell division and for the transcriptional regulation of genes essential for the function of the accessory glands. Downstream sequences of prd are necessary for the development of accessory glands. Here, we show that the upstream sequences also control prd expression in the adult accessory glands. The enhancer responsible for prd expression in the accessory glands has been mapped to a 590 bp fragment in the upstream region and shown to be crucial for the male fertility function. Interestingly, prd mutants rescued by a transgene, regulated by the entire upstream region but lacking the accessory gland enhancer, and by a transgene under control of the downstream region of prd develop accessory glands, but the glands are small in size and show reduced expression of Prd in freshly eclosed males. These glands gradually go through morphological changes that end with the complete collapse of the gland’s lumen while Prd protein levels are strongly elevated in virgin males older than 5 days. This persistent and strong expression of Prd might result from a failure in feedback regulation that is observed in the accessory glands of wild-type virgin males: prd transcription in accessory glands is repressed when the gland’s lumen is filled with secretory proteins, and this repression is relieved when the gland's content is emptied during mating.

Our earlier results suggest that prd is required for proper segmentation of the adult abdomen. Conditional knockout of prd in this study corroborated a crucial role of prd in adult cuticle segmentation. The enhancer partly responsible for the adult segmentation function has been identified in the downstream region of prd. It functions in the histoblasts to control the development of abdominal segments. This is evident from experiments demonstrating that the removal of prd function in the histoblasts is sufficient to produce the adult segmentation phenotype. Finally, we could identify the enhancers that control prd expression in the dorsal spot of embryos, in the ventral gustatory organ of the larvae, and in the trochanter segment of the legs.

In summary, several novel enhancers for newly discovered functions and/or expression patterns were characterized, more than initially expected.



2 Zusammenfassung Das paired (prd) Gen sowie die beiden Gene gooseberry (gsb) und gooseberry neuro (gsbn) von Drosophila sind die Gründungsmitglieder der Pax-Gen-Familie und ein Teil der Pax-3/7 Unterfamilie. Wie früher in diesem Labor gezeigt wurde, kodiert prd für einen Transkriptionsfaktor mit zwei DNA-bindenden Domänen, einer Paireddomäne und einer erweiterten Homeodomäne vom prd-Typ, in seiner N- terminalen Hälfte und gegen das C-terminale Ende mit einem 21 Aminosäure langen His-Pro oder PRD Repeat, der als starke Aktivierungsdomäne dient. Obwohl prd, gsb, gsbn und Pax3 unterschiedliche C-terminale Sequenzen und verschiedene Funktionen haben, besitzen sie hochkonservierte DNA-bindende Domänen in der N-terminalen Hälfte und entwickelten sich wahrscheinlich durch Gen-Duplikation aus dem gleichen Urgen. Zusammen mit anderen Paarregelgenen wirkt prd im Embryo bei der Etablierung der Position auf der von vorne nach hinten verlaufenden Achse mit, indem es die Transkription von Segment-Polaritätsgenen, einschliesslich gsb, wingless und engrailed aktiviert. Zusätzlich zu dieser Funktion während der embryonalen Segmentierung ist prd wichtig für die post-embryonale Entwicklung und für die Fruchtbarkeit von Männchen. Die schon erwähnten homologen Proteine, Gsb von Drosophila und Pax3 der Maus, sind in der Lage einige dieser Funktionen von prd auszuüben, wenn sie unter der Kontrolle der vollständigen cis-regulatorischen Region des prd Gens stehen. Daraus lässt sich schliessen, dass die cis-regulatorischen Elemente eine dominante Rolle während der Evolution spielen.

In dieser Forschungsarbeit analysierten wir die cis-regulatorischen Elemente von prd im Detail anhand einer Reihe von prd-Transgenen, welche die prd Mutanten nur partiell retten können und von prd-Reportergenen, die nur einen Teil der Expression von prd zeigen. Die Ergebnisse zeigen, dass es mindestens drei „Enhancer“-Regionen im prd Lokus gibt, die unabhängig von einander ein Streifen- Muster im Embryo bilden können. Unsere früheren Ergebnisse zeigten, dass mehrere cis-regulatorische Elemente, die vor dem prd Gen liegen, ein Streifen-Muster bilden können. Zu unserer Überraschung fanden wir jetzt, dass sowohl das Intron des prd Gens wie auch die Region hinter dem Gen dies unabhängig auch können. Nicht nur für das Expressionsmuster sondern auch für die Segmentierungsfunktion zeigen diese drei prd Enhancerregionen eine teilweise Redundanz. Die Haploinsuffizienz der



3 ‘upstream’-Enhancer von prd für das postembryonale Überleben und die Segmentierung im adulten Abdomen wurde mit prd-Transgenen gezeigt, welche die prd Mutanten nur teilweise retten. Diese Haploinsuffizienz der ‘upstream’-Enhancer kann durch nur ein einziges prd-Transgen unter der ausschliesslichen Kontrolle von ‘downstream’-Enhancern vollständig gerettet werden.

Die Untersuchung der Funktion von prd für die Fruchtbarkeit der Männchen hat früher ergeben, dass prd für die Entwicklung der akzessorischen Geschlechtsdrüse, die der Prostata von Säugetieren entspricht, unverzichtbar ist, da es dort die Zellteilung fördert und wichtige Gene für die Funktion der Drüse reguliert. Dabei wurde auch gezeigt, dass ‘downstream’-Sequenzen von prd für die Entwicklung der akzessorischen Geschlechtsdrüse unentbehrlich sind. Zu unserer Überraschung sind jedoch auch die ‘upstream’-Sequenzen wichtig für die korrekte Expression von prd in akzessorischen Geschlechtsdrüsen und dadurch für die Fruchtbarkeit der erwachsenen Männchen. Frisch geschlüpfte Männchen, die ohne den veranwortlichen 590-bp grossen ‘upstream’-Enhancer gerettet wurden, haben kleinere akzessorische Geschlechtsdrüsen mit verminderter Expression von prd. Mit dem Alter bricht das Lumen der Drüse vollständig zusammen und prd wird dann sogar stark überexprimiert. In der missgebildeten Drüse kommt diese Überexpression möglicherweise durch diesselbe Rückkoppelungs-Regulation zustande, die in der gesunden Drüse durch die Entleerung der Drüse während der Kopulierung beobachtet wurde. Denn prd wird in zölibatär gehaltenen Männchen fast vollständig reprimiert, höchstwahrscheinlich weil die Drüse gefüllt bleibt und kein Nachschub an sekretorischen Proteinen nötig ist. Erst die Entleerung der Drüse während der Kopulation führt zur Reaktivierung der prd Transkription.

Aufgrund von Experimenten, die in diesem Labor durchgeführt wurden, bestand der Verdacht, dass prd auch für die ordnungsgemäße Segmentierung während der Entwicklung des erwachsenen Abdomens sorgt. Die vollständig fusionierten abdominalen Segmente von Fliegen, bei denen fast alle postembryonale prd- Expression ausgeschaltet wurde, lassen jetzt keine Zweifel mehr offen. Der dafür teilweise verantwortliche Enhancer wurde hinter dem Gen identifiziert und funktioniert in Histoblasten während des Puppenstadiums, was gezeigt werden konnte, als prd nur in diesen Zellen ausgeschaltet wurde. Schliesslich konnten wir die

4 Enhancers identifizieren, welche die prd-Expression im dorsalen Fleck der Embryos, im ventralen Geschmacksorgan der Larven und im Trochanter-Segment der Beine der Puppen und erwachenen Fliegen steuern.

Zusammenfassend wurde eine Vielzahl von definierbaren Enhancern für neu entdeckte Funktionen und/oder Expressionsmuster von prd nachgewiesen, mehr als anfänglich erwartet.



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Noll Markus, Basler K
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:13 Feb 2010 08:55
Last Modified:24 Sep 2019 16:40
Number of Pages:84
Additional Information:Transcriptional regulation and functions of the Drosophila paired gene / von Sreehari Kalvakuri. - Zürich, 2009
OA Status:Green
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