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The transcriptomic profiling of human colorectal precancerous lesions


Cattaneo, Elisa. The transcriptomic profiling of human colorectal precancerous lesions. 2010, University of Zurich.

Abstract

Summary 

1.  SUMMARY 

Colorectal  tumorigenesis  is  one  of  the  best  known  processes  of  cellular  transformation in human beings.  Its characterization has moved ahead by leaps and  bounds  during  the  last  three  decades,  thanks  to  major  advances  in  the  fields  of  endoscopy, histology and molecular biology.  The carcinogenic process in the colon  starts when genetic or epigenetic alterations appear and accumulate in the cells of  epithelial crypts.  In most cases, the transformation process begins with qualitative,  quantitative, and spatial subversion of the Wnt signaling pathway, the physiological  regulator  of  epithelial  homeostasis.    Other  crucial  alterations  affect  key  genes  involved in different signal transduction pathways, apoptosis, and DNA repair such  as mismatch repair.  These events, which seem to appear at specific stages of tumor  progression, eventually lead to malignant and invasive neoplastic lesions.  Colorectal  cancer  was  assumed  for  many  years  to  be  a  homogenous  condition, but recently it turned out to include several distinct clinical, histological,  and molecular phenotypes.  Such heterogeneity can also be recognized in the lesions  believed  to  be  its  precursors.    Advances  in  the  fields  of  endoscopy  and  pathology  have  provided  us  with  a  more  accurate  classification  of  preinvasive  lesions,  which  better reflects their relevance in colorectal tumorigenesis.  Precancerous colorectal  lesions  have  been  thus  reclassified  into  different  categories  based  on  their  morphological and histological appearance.  Macroscopically, they are divided into  polypoid  (pedunculated  and  sessile)  and  nonpolypoid  (slightly  elevated,  completely  flat  or  depressed)  lesions.    Histologically,  they  can  present  classical  adenomatous  features  or  a  peculiar  architecture  characterized  by  infolding  of  the  glandular  epithelium  (also  called  serration).    Serrated  lesions  display  some  molecular  alterations usually non detected in adenomas, and they are believed to progress into  colorectal cancer by means of a new pathway of tumorigenesis, namely the serrated  pathway.    The  distinction  of  precancerous  colorectal  lesions  based  on  their  morphology,  and  the  belief  that  they  represent  different  entities,  were  the  central  themes  driving  the  design  of  this  study.    In  an  attempt  to  identify  genes  and  pathways  whose  dysregulation  might  play  crucial  roles  in  the  transformation 

4                                                                                                                                                Summary 

process, we performed a comprehensive transcriptomic analysis of nonpolypoid and  polypoid  colorectal  precancerous  lesions.    Our  study  represents  the  first  gene  expression  analysis  of  a  large  collection  of  the  two  types  of  precancerous  lesions.   Furthermore,  it  was  carried  out  using  the  Affymetrix  exon  array  platform  that  allowed us to investigate the expression level of all transcripts of the human genome  with unprecedented sensitivity.  The in‐depth analysis of our transcriptomics data revealed that the two types  of  precancerous  lesions  could  be  easily  segregated  into  different  clusters  using  several  unsupervised  and  supervised  analytical  tools.    A  prominent  prevalence  of  expression changes in genes involved in cell cycle related networks was observed in  the  polypoid  group  of  lesions,  suggesting  that  a  profound  dysregulation  of  the  cell  cycle  is  crucial  for  propulsion  of  cell  proliferation  in  these  lesions.    In  contrast,  nonpolypoid  lesions  were  characterized  by  an  overrepresentation  of  expression  changes  in  genes  involved  in  growth  factor  signaling  pathways,  apoptosis  and  cell  adhesion,  suggesting  that  these  lesions  might  exploit  activation  of  cell  survival  pathways and avoidance of apoptosis for their progression.  We have identified a list  of  genes  whose  expression  changes  are  more  specifically  associated  with  the  polypoid  or  the  nonpolypoid  phenotype.    These  changes  will  be  complemented  by  additional  data  from  other  ‐omics  studies  (a  metabolomics  study  is  in  progress  in  our  laboratory)  in  order  to  investigate  the  differences  between  polypoid  and  nonpolypoid lesions within a systems biology framework.  The data analysis also showed that the transcriptome of nonpolypoid lesions  was  less  dramatically  subverted  than  that  of  the  polypoid  lesions  (in  comparison  with  normal  mucosa  samples).    In  a  large  proportion  of  changes,  the  up‐  or  downregulation  of  transcript  levels  followed  a  normal  mucosa    nonpolypoid    polypoid sequence, although expression values in nonpolypoid lesions were always  closer  to  that  of  the  cognate,  precancerous  group  of  samples.    Certain  biological  processes,  such  as  Wnt  signaling,  cytoskeleton  remodelling  and  immune  response,  were  similarly  dysregulated  in  the  two  groups  of  lesions.    In  addition,  supervised  analyses identified the diameter of the lesions and degree of cytological dysplasia as  the  two  most  relevant  clinical  variables  associated  with  specific  patterns  of  gene 

5                                                                                                                                                Summary 

expression, as was the case also for polypoid lesions in a previous study conducted  in our laboratory.    In  conclusion,  although  nonpolypoid  lesions  appear  to  explore  different  pathways of transformation, they also share many similarities with polypoid lesions.  This  was  expected,  since  both  precancerous  lesions  arise  and  grow  in  the  same  organ and are likely forced to overcome a series of similar selection pressures.  At  this  stage  of  our  investigation,  we  could  only  suggest  that  it  is  wise  to  apply  the  same level of clinical surveillance to both types of precancerous lesions.     One  gene  transcript  whose  expression  changes  were  dramatic  in  all  the  precancerous  lesions  was  TMIGD1  (transmembrane  and  immunoglobulin  domain  containing 1).  In comparison with the transcript levels in the corresponding normal  mucosa  samples,  TMIGD1  was  found  to  be  19  and  66  (log2  values)  times  less  expressed  in  nonpolypoid  and  polypoid  lesions  respectively,  and  even  more  ‐152  fold  ‐  in  adenocarcinomas.    This  striking  phenomenon  and  the  originality  of  the  finding (probes for the analysis of the expression level of this gene were not present  in  the  microarray  platforms  used  in  previous  studies),  along  with  the  fact  that  its  biological  function  is  presently  unknown,  prompted  us  to  invest  time  in  a  better  characterization of its expression profile (mRNA as well as its protein product).   We could fully confirm the microarray data by analyzing the studied samples  with real‐time quantitative RT‐PCR.  In addition, we extended this analysis to other  tissues  and  we  found  that  the  expression  of  the  TMIGD1  mRNA  was  higher  in  the  lower  gastrointestinal  tract  and  kidney.    The  stable  expression  of  the  full  length  TMIGD1  cDNA  in  TMIGD1‐deficient  SW480  colon  cancer  cells  showed  that  this  protein is expressed in the cytoplasm.  An accumulation of TMIGD1 was evident in  the  perinuclear  compartment  (likely  associated  with  the  rough  endoplasmic  reticulum, but also localization in mitochondria should be considered), however the  entire cytoplasm and the cell membrane were also stained.  The fiber‐like pattern of  staining suggests that TMIGD1 might be associated also with the cytoskeleton.   In  immunohistochemical  studies,  the  expression  of  TMIGD1  was  limited  to  the  upper  portion  of  the  intestinal  epithelial  crypts  (where  differentiated  cells  are 

6                                                                                                                                                Summary 

located),  while  it  was  absent  in  the  proliferative  compartment.    In  the  villi  of  the  terminal  ileum  and  in  renal  tubules,  TMIGD1  was  markedly  localized  in  the  brush  border.    As  expected,  its  expression  decreased  dramatically  in  nonpolypoid  and  polypoid  lesions,  as  well  as  in  adenocarcinomas.    Interestingly,  the  staining  for  TMIGD1 was correlated with the degree of cellular differentiation and its expression  was completely lost in poorly differentiated neoplasms.  TMIGD1 might therefore be  a novel marker of epithelial differentiation in the lower gastrointestinal tract and in  the kidney.  The effects of its downregulation during the transformation process in  the colorectum remain to be elucidated.       



7                                                                                                                               Zusammenfassung 

2.  ZUSAMMENFASSUNG 

Die  Entstehung  von  Darmkrebs  beim  Menschen  ist  einer  der  am  besten  verstandenen Abläufe der zellulären Entartung. Das Verständnis dieses Prozesses ist  in  den  letzten  drei  Jahrzehnten  sprunghaft  angestiegen,  nicht  zuletzt  durch  die  Fortschritte  auf  den  Gebieten  der  Endoskopie,  der  Histologie  und  der  Molekularbiologie.  Der  kanzerogene  Prozess  beginnt,  wenn  genetische  oder  epigenetische Veränderungen in den Zellen der Krypten des Darmepithels auftreten  und  sich  anhäufen.  In  den  meisten  Fällen  geht  diese  Transformation  mit  einer  qualitativen,  quantitativen  und  räumlichen  Zerstörung  des  Wnt‐Signalweges,  dem  physiologischen  Regulator  der  zellulären  Homeostasis,  einher.  Weitere  wichtige  Veränderungen betreffen Schlüsselgene, welche in verschiedenen Signalwegen, dem  programmierten  Zelltod  und  DNA‐Reparaturwegen,  z.B.  der  postreplikativen  Fehlpaarungsreparatur,  eine  wichtige  Rolle  spielen.  Diese  Ereignisse  scheinen  bestimmte  Abschnitte  der  Krebsentwicklung  zu  kennzeichnen  und  führen  möglicherweise zu dem Entstehen bösartiger und invasiver Tumore.    Im Falle des Darmkrebses nahm man lange Zeit an, dass es sich um ein relativ  einheitliches  Krankheitsbild  handele.  In  neuere  Studien  wurden  jedoch  unterschiedliche  klinische,  histologische  und  molekulare  Krankheitsbilder  festgestellt. Diese Unterschiede können auch schon in Vorläuferstadien der Tumore  beobachtet  werden.  Fortschritte  in  der  Endoskopie  und  Pathologie  ermöglichen  heutzutage  eine  bessere  Klassifizierung  der  prä‐invasiven  Läsionen  wodurch  sich  genauere  Rückschlüsse  auf  die  weitere  Entartung  schließen  lassen. Daher  hat man  die  Vorläuferstadien  des  Darmkrebses,  basierend  auf  dem  morphologischen  und  histologischen  Erscheinungsbild,  neu  gruppiert.  Makroskopisch  unterscheidet  man  polypöse (gestielt und  festsitzend) und nicht‐polypöse (leicht erhöhte, flache oder  eingedrückte)  Läsionen.  Histologisch  gesehen  kommen  klassische  adenomähnliche  Formen  vor  oder  Formen  die  durch  eine  seltsame  Einstülpung  des  Drüsenepithels  (auch  gezahnt  genannt)  gekennzeichnet  sind.  Gezahnte  Läsionen  weisen  einige  molekulare  Veränderungen  auf,  die  normalerweise  nicht  in  Adenomen  beobachtet  werden.  Man  geht  davon  aus,  dass  sich  diese  über  einen  neuartigen  Weg  zu 

8                                                                                                                               Zusammenfassung 

Darmkrebs  ausweiten  können,  den  so  genannten  „gezahnten“  Weg.  Die  Unterscheidung  von  präkanzerösen  Läsionen  mittels  ihrer  Morphologie  und  die  Annahme, dass diese verschiedene Einheiten darstellen, war das zentrale Leitmotiv  für  die  Aufnahme  dieser  Studie.  In  dem  Versuch  Gene  und  Signalwege  zu  identifizieren, deren Deregulation ein wichtige Rolle in der Krebsentstehung spielt,  haben  wir  eine  umfassende  Transkriptions‐Analyse  von  nicht‐polypösen  und  polypösen  Läsionen,  die  als  Darmkrebsvorläufer  angesehen  werden  können,  durchgeführt.  Unsere  Studie  ist  daher  die  erste  Genexpressionsanalyse  mit  einer  großen Anzahl dieser beiden unterschiedlichen Arten von präkanzerösen Läsionen.  Darüber hinaus haben wir unsere Analyse mir der Affymetrix exon array Plattform  durchgeführt,  die  es  uns  erlaubt  die  Expressionsniveaus  aller  Transkripte  des  menschlichen Genoms in nie da gewesener Genauigkeit zu untersuchen.    Die  Analyse  unserer  Daten  durch  ungeordnete  und  geordnete  Methoden  zeigte,  dass  sich  beide  Arten  der  präkanzerösen  Läsionen  leicht  in  zwei  unterschiedliche  Gruppen  aufteilen  lassen.  In  der  Gruppe  der  polypösen  Läsionen  zeigten  Gene,  welche  mit  dem  Zellzyklus  assoziiert  sind,  ein  verändertes  Expressionsmuster.  Dies  legt  nahe,  dass  eine  massive  Deregulation  des  Zellzyklus  für die Proliferation der Zellen bei dieser Art der Läsion von Nöten ist. Im Gegensatz  dazu  werden  die  nicht‐polypösen  Läsionen  dadurch  gekennzeichnet,  dass  sie  eine  Überexpression  von  Genen  aufweisen,  welche  in  Signalwegen  von  Wachstumsfaktoren,  dem  programmierten  Zelltod  oder  der  Zelladhäsion  ein  Rolle  spielen. Dies lässt darauf schließen, dass eine Aktivierung von Signalwegen nötig ist,  die  das  Überleben  der  Zellen  fördern  und  den  Zelltod  unterdrücken.  Wir  konnten  eine  Liste  von  Genen  erstellen,  deren  veränderte  Expression  mit  dem  polypösen  oder  nicht‐polypösen  Erscheinungsbild  der  Läsionen  assoziiert  ist.  Diese  Änderungen  werden  durch  Daten  von  anderen  „‐omics“‐Studien    (eine  Metabolomics‐Studie wird zurzeit in unserem Labor durchgeführt) vervollständigt.  Dadurch  erhoffen  wir  uns,  die  Unterschiede  zwischen  polypösen  und  nicht‐ polpöyen Läsionen in einem systembiologischen Rahmenwerk studieren zu können.    Die  Analyse  unserer  Daten  zeigt  zudem,  dass  das  Transkriptom  der  nicht‐ polypösen  Läsionen  weniger  „zerrüttet“  war  als  das  der    polypösen  Läsionen  (im 

9                                                                                                                               Zusammenfassung 

Vergleich  zu  den  Proben  der  normalen  Schleimhaut).  Die  meisten  Veränderungen  der Hoch‐ oder Runterregulierung der Transkripte folgten einem ähnlichen Muster:  normale Schleimhaut  nicht polypöse Läsion  polypöse Läsion (wobei die Werte  der  nicht‐polypösen  Läsionen  immer  näher  an  den  Werten  ihrer  verwandten  Gruppe,  der  polypösen  Läsionen,  lagen).  Bestimmte  biologische  Prozesse,  wie  der  Wnt  ‐Signalweg,  der  Aufbau  der  Zytoskeletts  und  die  Immunantwort,  waren  in  beiden  Gruppen  gleichermaßen  verändert.  Zusätzlich  stellten  wir  mittels  „überwachten“  multivarianten  Analysen  fest,  dass  die  zwei  klinisch  relevanten  Variablen  (Durchmesser  der  Läsionen  und  Grad  der  zytologischen  Entartung)  mit  einem  bestimmten  Muster  der  Genexpression  assoziiert  sind,  wie  es  auch  in  einer  früheren  Studie  aus  unserem  Labor  mit  polypösen  Läsionen  der  Fall  war.  Zusammengefasst  lässt  sich  sagen,  dass  nicht‐polypöse  und  polypöse  Läsionen  vielen  Gemeinsamkeiten  aufweisen,  obwohl  die  nicht‐polypösen  Läsionen  einen  anderen  Weg  der  malignen  Entartung  einschlagen.  Dies  war  in  sofern  nicht  verwunderlich, als dass die präkanzerösen Läsionen im selben Organ entstehen und  daher  sehr  wahrscheinlich  ist,  dass  für  ihre  maligne  Transformation  ähnliche  Hürden  überwunden  werden  müssen.  Folglich  lässt  sich  durch  unsere  Studie  schließen, dass es sinnvoll wäre, bei beiden Arten der präkanzerösen Läsionen die  gleichen klinischen Beobachtungen einzuleiten.    Ein  Transkript,  dessen  Expression  sich  in  allen  prä‐kanzerogenen  Läsionen  sehr  drastisch  verändert  ist  TMIGD1(transmembrane  and  immunoglobulin  domain  containing  1).  Im  Vergleich  zu  den  Transkriptionsniveaus  in  den  entsprechenden  Proben der normalen Schleimhaut, wurde TMIGD1 in nicht‐polypösen Läsionen  und  polypösen  Läsionen  19‐fach  bzw.  66‐fach  geringer  exprimiert  (log2  Werte)  und  in  Adenokarzinomen  sogar  152‐fach.  Diese  beachtliche  Tatsache  und  die  Originalität  unserer  Ergebnisse  (in  unserer  Analyse  wurde  die  Expression  dieses  Genes  im  Gegensatz  zu  früheren  Microarrays  durch  spezifische  Sonden  für  abgedeckt),  und  die  Tatsache,  dass  die  biologische  Funktion  bisher  nicht  bekannt  ist,  veranlassten  uns  dazu,  eine  bessere  Charakterisierung  des  Expressionsprofils  zu  beginnen  (sowohl auf mRNA‐als auch auf Proteinniveau).  



10                                                                                                                               Zusammenfassung 

  Wir  konnten  die  Daten  der  Microarray  Analyse  durch  eine  quantitative  RT‐ PCR bestätigen. Zudem haben wir die Expression in weiteren Geweben untersucht  und festgestellt, dass die Expression der TMIGD1 mRNA im unteren Margen‐Darm‐ Trakt  und  in  der  Niere  erhöht  ist.  Die  stabile  Expression  der  kompletten  TMIGD1  cDNA  in  der  TMIGD1‐defizienten  Krebszelllinie  SW480  zeigte,  dass  das  Protein  im  Zytoplasma  exprimiert  wird.    Wir  stellten  sowohl  eine  perinukleäre  Ansammlung  des  Proteins  (sehr  wahrscheinlich  handelt  es  sich  um  eine  Assoziation  mit  dem  rauen  endoplasmatischen  Retikulum,  jedoch  sollte  ein  Lokalisation  in  den  Mitochondrien  nicht  ausser  Acht  gelassen  werden)  als  auch  eine  Lokalisation  im  gesamten  Zytoplasma  und  an  der  Zellmembran  fest.  Die  faserartige  Färbung  legt  eine Assoziation von TMIGD1 mit dem Zytoskelett nahe.    Durch  immunohistochemische  Analysen  konnten  wir  zeigen,  dass  die  Expression  von  TMIGD1  auf  dem  oberen  Abschnitt  der  intestinalen‐epithelialen  Krypten  beschränkt  war  (hier  befinden  sich  differenzierte  Zellen),  wobei  die  Expression  in  den  zellteilungs‐aktiven  Bereichen  fehlte.  In  den  Zotten  des  terminalen  Ileums  und  in  den  Nierengefäßen  lokalisierte  TMIGD1  eindeutig  im  Bürstensaum.  Wir  zu  erwarten  war,  war  die  Expression  in  nicht‐polypösen  und  polypösen  Läsion  als  auch  in  den  Adenokarzinomen  dramatisch  reduziert.  Interessanterweise  zeigte  die  Färbung  für  TMIGD1  eine  Korrelation  zwischen  dem  Grad  der  zellulären  Differenzierung,  wobei  die  Expression  in  schwach  differenzierten gänzlich Neoplasma fehlte. Daher könnte TMIGD1 ein neuer Marker  für die epitheliale Differenzierung im unteren Margen‐Darm‐Traks und in der Niere  angesehen  werden.  Die  Auswirkungen  der  Runterregulierung  während  der  zellulären Entartung während Darmkrebsentwicklung werden Gegenstand weiterer  Untersuchungen sein.   



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Abstract

Summary 

1.  SUMMARY 

Colorectal  tumorigenesis  is  one  of  the  best  known  processes  of  cellular  transformation in human beings.  Its characterization has moved ahead by leaps and  bounds  during  the  last  three  decades,  thanks  to  major  advances  in  the  fields  of  endoscopy, histology and molecular biology.  The carcinogenic process in the colon  starts when genetic or epigenetic alterations appear and accumulate in the cells of  epithelial crypts.  In most cases, the transformation process begins with qualitative,  quantitative, and spatial subversion of the Wnt signaling pathway, the physiological  regulator  of  epithelial  homeostasis.    Other  crucial  alterations  affect  key  genes  involved in different signal transduction pathways, apoptosis, and DNA repair such  as mismatch repair.  These events, which seem to appear at specific stages of tumor  progression, eventually lead to malignant and invasive neoplastic lesions.  Colorectal  cancer  was  assumed  for  many  years  to  be  a  homogenous  condition, but recently it turned out to include several distinct clinical, histological,  and molecular phenotypes.  Such heterogeneity can also be recognized in the lesions  believed  to  be  its  precursors.    Advances  in  the  fields  of  endoscopy  and  pathology  have  provided  us  with  a  more  accurate  classification  of  preinvasive  lesions,  which  better reflects their relevance in colorectal tumorigenesis.  Precancerous colorectal  lesions  have  been  thus  reclassified  into  different  categories  based  on  their  morphological and histological appearance.  Macroscopically, they are divided into  polypoid  (pedunculated  and  sessile)  and  nonpolypoid  (slightly  elevated,  completely  flat  or  depressed)  lesions.    Histologically,  they  can  present  classical  adenomatous  features  or  a  peculiar  architecture  characterized  by  infolding  of  the  glandular  epithelium  (also  called  serration).    Serrated  lesions  display  some  molecular  alterations usually non detected in adenomas, and they are believed to progress into  colorectal cancer by means of a new pathway of tumorigenesis, namely the serrated  pathway.    The  distinction  of  precancerous  colorectal  lesions  based  on  their  morphology,  and  the  belief  that  they  represent  different  entities,  were  the  central  themes  driving  the  design  of  this  study.    In  an  attempt  to  identify  genes  and  pathways  whose  dysregulation  might  play  crucial  roles  in  the  transformation 

4                                                                                                                                                Summary 

process, we performed a comprehensive transcriptomic analysis of nonpolypoid and  polypoid  colorectal  precancerous  lesions.    Our  study  represents  the  first  gene  expression  analysis  of  a  large  collection  of  the  two  types  of  precancerous  lesions.   Furthermore,  it  was  carried  out  using  the  Affymetrix  exon  array  platform  that  allowed us to investigate the expression level of all transcripts of the human genome  with unprecedented sensitivity.  The in‐depth analysis of our transcriptomics data revealed that the two types  of  precancerous  lesions  could  be  easily  segregated  into  different  clusters  using  several  unsupervised  and  supervised  analytical  tools.    A  prominent  prevalence  of  expression changes in genes involved in cell cycle related networks was observed in  the  polypoid  group  of  lesions,  suggesting  that  a  profound  dysregulation  of  the  cell  cycle  is  crucial  for  propulsion  of  cell  proliferation  in  these  lesions.    In  contrast,  nonpolypoid  lesions  were  characterized  by  an  overrepresentation  of  expression  changes  in  genes  involved  in  growth  factor  signaling  pathways,  apoptosis  and  cell  adhesion,  suggesting  that  these  lesions  might  exploit  activation  of  cell  survival  pathways and avoidance of apoptosis for their progression.  We have identified a list  of  genes  whose  expression  changes  are  more  specifically  associated  with  the  polypoid  or  the  nonpolypoid  phenotype.    These  changes  will  be  complemented  by  additional  data  from  other  ‐omics  studies  (a  metabolomics  study  is  in  progress  in  our  laboratory)  in  order  to  investigate  the  differences  between  polypoid  and  nonpolypoid lesions within a systems biology framework.  The data analysis also showed that the transcriptome of nonpolypoid lesions  was  less  dramatically  subverted  than  that  of  the  polypoid  lesions  (in  comparison  with  normal  mucosa  samples).    In  a  large  proportion  of  changes,  the  up‐  or  downregulation  of  transcript  levels  followed  a  normal  mucosa    nonpolypoid    polypoid sequence, although expression values in nonpolypoid lesions were always  closer  to  that  of  the  cognate,  precancerous  group  of  samples.    Certain  biological  processes,  such  as  Wnt  signaling,  cytoskeleton  remodelling  and  immune  response,  were  similarly  dysregulated  in  the  two  groups  of  lesions.    In  addition,  supervised  analyses identified the diameter of the lesions and degree of cytological dysplasia as  the  two  most  relevant  clinical  variables  associated  with  specific  patterns  of  gene 

5                                                                                                                                                Summary 

expression, as was the case also for polypoid lesions in a previous study conducted  in our laboratory.    In  conclusion,  although  nonpolypoid  lesions  appear  to  explore  different  pathways of transformation, they also share many similarities with polypoid lesions.  This  was  expected,  since  both  precancerous  lesions  arise  and  grow  in  the  same  organ and are likely forced to overcome a series of similar selection pressures.  At  this  stage  of  our  investigation,  we  could  only  suggest  that  it  is  wise  to  apply  the  same level of clinical surveillance to both types of precancerous lesions.     One  gene  transcript  whose  expression  changes  were  dramatic  in  all  the  precancerous  lesions  was  TMIGD1  (transmembrane  and  immunoglobulin  domain  containing 1).  In comparison with the transcript levels in the corresponding normal  mucosa  samples,  TMIGD1  was  found  to  be  19  and  66  (log2  values)  times  less  expressed  in  nonpolypoid  and  polypoid  lesions  respectively,  and  even  more  ‐152  fold  ‐  in  adenocarcinomas.    This  striking  phenomenon  and  the  originality  of  the  finding (probes for the analysis of the expression level of this gene were not present  in  the  microarray  platforms  used  in  previous  studies),  along  with  the  fact  that  its  biological  function  is  presently  unknown,  prompted  us  to  invest  time  in  a  better  characterization of its expression profile (mRNA as well as its protein product).   We could fully confirm the microarray data by analyzing the studied samples  with real‐time quantitative RT‐PCR.  In addition, we extended this analysis to other  tissues  and  we  found  that  the  expression  of  the  TMIGD1  mRNA  was  higher  in  the  lower  gastrointestinal  tract  and  kidney.    The  stable  expression  of  the  full  length  TMIGD1  cDNA  in  TMIGD1‐deficient  SW480  colon  cancer  cells  showed  that  this  protein is expressed in the cytoplasm.  An accumulation of TMIGD1 was evident in  the  perinuclear  compartment  (likely  associated  with  the  rough  endoplasmic  reticulum, but also localization in mitochondria should be considered), however the  entire cytoplasm and the cell membrane were also stained.  The fiber‐like pattern of  staining suggests that TMIGD1 might be associated also with the cytoskeleton.   In  immunohistochemical  studies,  the  expression  of  TMIGD1  was  limited  to  the  upper  portion  of  the  intestinal  epithelial  crypts  (where  differentiated  cells  are 

6                                                                                                                                                Summary 

located),  while  it  was  absent  in  the  proliferative  compartment.    In  the  villi  of  the  terminal  ileum  and  in  renal  tubules,  TMIGD1  was  markedly  localized  in  the  brush  border.    As  expected,  its  expression  decreased  dramatically  in  nonpolypoid  and  polypoid  lesions,  as  well  as  in  adenocarcinomas.    Interestingly,  the  staining  for  TMIGD1 was correlated with the degree of cellular differentiation and its expression  was completely lost in poorly differentiated neoplasms.  TMIGD1 might therefore be  a novel marker of epithelial differentiation in the lower gastrointestinal tract and in  the kidney.  The effects of its downregulation during the transformation process in  the colorectum remain to be elucidated.       



7                                                                                                                               Zusammenfassung 

2.  ZUSAMMENFASSUNG 

Die  Entstehung  von  Darmkrebs  beim  Menschen  ist  einer  der  am  besten  verstandenen Abläufe der zellulären Entartung. Das Verständnis dieses Prozesses ist  in  den  letzten  drei  Jahrzehnten  sprunghaft  angestiegen,  nicht  zuletzt  durch  die  Fortschritte  auf  den  Gebieten  der  Endoskopie,  der  Histologie  und  der  Molekularbiologie.  Der  kanzerogene  Prozess  beginnt,  wenn  genetische  oder  epigenetische Veränderungen in den Zellen der Krypten des Darmepithels auftreten  und  sich  anhäufen.  In  den  meisten  Fällen  geht  diese  Transformation  mit  einer  qualitativen,  quantitativen  und  räumlichen  Zerstörung  des  Wnt‐Signalweges,  dem  physiologischen  Regulator  der  zellulären  Homeostasis,  einher.  Weitere  wichtige  Veränderungen betreffen Schlüsselgene, welche in verschiedenen Signalwegen, dem  programmierten  Zelltod  und  DNA‐Reparaturwegen,  z.B.  der  postreplikativen  Fehlpaarungsreparatur,  eine  wichtige  Rolle  spielen.  Diese  Ereignisse  scheinen  bestimmte  Abschnitte  der  Krebsentwicklung  zu  kennzeichnen  und  führen  möglicherweise zu dem Entstehen bösartiger und invasiver Tumore.    Im Falle des Darmkrebses nahm man lange Zeit an, dass es sich um ein relativ  einheitliches  Krankheitsbild  handele.  In  neuere  Studien  wurden  jedoch  unterschiedliche  klinische,  histologische  und  molekulare  Krankheitsbilder  festgestellt. Diese Unterschiede können auch schon in Vorläuferstadien der Tumore  beobachtet  werden.  Fortschritte  in  der  Endoskopie  und  Pathologie  ermöglichen  heutzutage  eine  bessere  Klassifizierung  der  prä‐invasiven  Läsionen  wodurch  sich  genauere  Rückschlüsse  auf  die  weitere  Entartung  schließen  lassen. Daher  hat man  die  Vorläuferstadien  des  Darmkrebses,  basierend  auf  dem  morphologischen  und  histologischen  Erscheinungsbild,  neu  gruppiert.  Makroskopisch  unterscheidet  man  polypöse (gestielt und  festsitzend) und nicht‐polypöse (leicht erhöhte, flache oder  eingedrückte)  Läsionen.  Histologisch  gesehen  kommen  klassische  adenomähnliche  Formen  vor  oder  Formen  die  durch  eine  seltsame  Einstülpung  des  Drüsenepithels  (auch  gezahnt  genannt)  gekennzeichnet  sind.  Gezahnte  Läsionen  weisen  einige  molekulare  Veränderungen  auf,  die  normalerweise  nicht  in  Adenomen  beobachtet  werden.  Man  geht  davon  aus,  dass  sich  diese  über  einen  neuartigen  Weg  zu 

8                                                                                                                               Zusammenfassung 

Darmkrebs  ausweiten  können,  den  so  genannten  „gezahnten“  Weg.  Die  Unterscheidung  von  präkanzerösen  Läsionen  mittels  ihrer  Morphologie  und  die  Annahme, dass diese verschiedene Einheiten darstellen, war das zentrale Leitmotiv  für  die  Aufnahme  dieser  Studie.  In  dem  Versuch  Gene  und  Signalwege  zu  identifizieren, deren Deregulation ein wichtige Rolle in der Krebsentstehung spielt,  haben  wir  eine  umfassende  Transkriptions‐Analyse  von  nicht‐polypösen  und  polypösen  Läsionen,  die  als  Darmkrebsvorläufer  angesehen  werden  können,  durchgeführt.  Unsere  Studie  ist  daher  die  erste  Genexpressionsanalyse  mit  einer  großen Anzahl dieser beiden unterschiedlichen Arten von präkanzerösen Läsionen.  Darüber hinaus haben wir unsere Analyse mir der Affymetrix exon array Plattform  durchgeführt,  die  es  uns  erlaubt  die  Expressionsniveaus  aller  Transkripte  des  menschlichen Genoms in nie da gewesener Genauigkeit zu untersuchen.    Die  Analyse  unserer  Daten  durch  ungeordnete  und  geordnete  Methoden  zeigte,  dass  sich  beide  Arten  der  präkanzerösen  Läsionen  leicht  in  zwei  unterschiedliche  Gruppen  aufteilen  lassen.  In  der  Gruppe  der  polypösen  Läsionen  zeigten  Gene,  welche  mit  dem  Zellzyklus  assoziiert  sind,  ein  verändertes  Expressionsmuster.  Dies  legt  nahe,  dass  eine  massive  Deregulation  des  Zellzyklus  für die Proliferation der Zellen bei dieser Art der Läsion von Nöten ist. Im Gegensatz  dazu  werden  die  nicht‐polypösen  Läsionen  dadurch  gekennzeichnet,  dass  sie  eine  Überexpression  von  Genen  aufweisen,  welche  in  Signalwegen  von  Wachstumsfaktoren,  dem  programmierten  Zelltod  oder  der  Zelladhäsion  ein  Rolle  spielen. Dies lässt darauf schließen, dass eine Aktivierung von Signalwegen nötig ist,  die  das  Überleben  der  Zellen  fördern  und  den  Zelltod  unterdrücken.  Wir  konnten  eine  Liste  von  Genen  erstellen,  deren  veränderte  Expression  mit  dem  polypösen  oder  nicht‐polypösen  Erscheinungsbild  der  Läsionen  assoziiert  ist.  Diese  Änderungen  werden  durch  Daten  von  anderen  „‐omics“‐Studien    (eine  Metabolomics‐Studie wird zurzeit in unserem Labor durchgeführt) vervollständigt.  Dadurch  erhoffen  wir  uns,  die  Unterschiede  zwischen  polypösen  und  nicht‐ polpöyen Läsionen in einem systembiologischen Rahmenwerk studieren zu können.    Die  Analyse  unserer  Daten  zeigt  zudem,  dass  das  Transkriptom  der  nicht‐ polypösen  Läsionen  weniger  „zerrüttet“  war  als  das  der    polypösen  Läsionen  (im 

9                                                                                                                               Zusammenfassung 

Vergleich  zu  den  Proben  der  normalen  Schleimhaut).  Die  meisten  Veränderungen  der Hoch‐ oder Runterregulierung der Transkripte folgten einem ähnlichen Muster:  normale Schleimhaut  nicht polypöse Läsion  polypöse Läsion (wobei die Werte  der  nicht‐polypösen  Läsionen  immer  näher  an  den  Werten  ihrer  verwandten  Gruppe,  der  polypösen  Läsionen,  lagen).  Bestimmte  biologische  Prozesse,  wie  der  Wnt  ‐Signalweg,  der  Aufbau  der  Zytoskeletts  und  die  Immunantwort,  waren  in  beiden  Gruppen  gleichermaßen  verändert.  Zusätzlich  stellten  wir  mittels  „überwachten“  multivarianten  Analysen  fest,  dass  die  zwei  klinisch  relevanten  Variablen  (Durchmesser  der  Läsionen  und  Grad  der  zytologischen  Entartung)  mit  einem  bestimmten  Muster  der  Genexpression  assoziiert  sind,  wie  es  auch  in  einer  früheren  Studie  aus  unserem  Labor  mit  polypösen  Läsionen  der  Fall  war.  Zusammengefasst  lässt  sich  sagen,  dass  nicht‐polypöse  und  polypöse  Läsionen  vielen  Gemeinsamkeiten  aufweisen,  obwohl  die  nicht‐polypösen  Läsionen  einen  anderen  Weg  der  malignen  Entartung  einschlagen.  Dies  war  in  sofern  nicht  verwunderlich, als dass die präkanzerösen Läsionen im selben Organ entstehen und  daher  sehr  wahrscheinlich  ist,  dass  für  ihre  maligne  Transformation  ähnliche  Hürden  überwunden  werden  müssen.  Folglich  lässt  sich  durch  unsere  Studie  schließen, dass es sinnvoll wäre, bei beiden Arten der präkanzerösen Läsionen die  gleichen klinischen Beobachtungen einzuleiten.    Ein  Transkript,  dessen  Expression  sich  in  allen  prä‐kanzerogenen  Läsionen  sehr  drastisch  verändert  ist  TMIGD1(transmembrane  and  immunoglobulin  domain  containing  1).  Im  Vergleich  zu  den  Transkriptionsniveaus  in  den  entsprechenden  Proben der normalen Schleimhaut, wurde TMIGD1 in nicht‐polypösen Läsionen  und  polypösen  Läsionen  19‐fach  bzw.  66‐fach  geringer  exprimiert  (log2  Werte)  und  in  Adenokarzinomen  sogar  152‐fach.  Diese  beachtliche  Tatsache  und  die  Originalität  unserer  Ergebnisse  (in  unserer  Analyse  wurde  die  Expression  dieses  Genes  im  Gegensatz  zu  früheren  Microarrays  durch  spezifische  Sonden  für  abgedeckt),  und  die  Tatsache,  dass  die  biologische  Funktion  bisher  nicht  bekannt  ist,  veranlassten  uns  dazu,  eine  bessere  Charakterisierung  des  Expressionsprofils  zu  beginnen  (sowohl auf mRNA‐als auch auf Proteinniveau).  



10                                                                                                                               Zusammenfassung 

  Wir  konnten  die  Daten  der  Microarray  Analyse  durch  eine  quantitative  RT‐ PCR bestätigen. Zudem haben wir die Expression in weiteren Geweben untersucht  und festgestellt, dass die Expression der TMIGD1 mRNA im unteren Margen‐Darm‐ Trakt  und  in  der  Niere  erhöht  ist.  Die  stabile  Expression  der  kompletten  TMIGD1  cDNA  in  der  TMIGD1‐defizienten  Krebszelllinie  SW480  zeigte,  dass  das  Protein  im  Zytoplasma  exprimiert  wird.    Wir  stellten  sowohl  eine  perinukleäre  Ansammlung  des  Proteins  (sehr  wahrscheinlich  handelt  es  sich  um  eine  Assoziation  mit  dem  rauen  endoplasmatischen  Retikulum,  jedoch  sollte  ein  Lokalisation  in  den  Mitochondrien  nicht  ausser  Acht  gelassen  werden)  als  auch  eine  Lokalisation  im  gesamten  Zytoplasma  und  an  der  Zellmembran  fest.  Die  faserartige  Färbung  legt  eine Assoziation von TMIGD1 mit dem Zytoskelett nahe.    Durch  immunohistochemische  Analysen  konnten  wir  zeigen,  dass  die  Expression  von  TMIGD1  auf  dem  oberen  Abschnitt  der  intestinalen‐epithelialen  Krypten  beschränkt  war  (hier  befinden  sich  differenzierte  Zellen),  wobei  die  Expression  in  den  zellteilungs‐aktiven  Bereichen  fehlte.  In  den  Zotten  des  terminalen  Ileums  und  in  den  Nierengefäßen  lokalisierte  TMIGD1  eindeutig  im  Bürstensaum.  Wir  zu  erwarten  war,  war  die  Expression  in  nicht‐polypösen  und  polypösen  Läsion  als  auch  in  den  Adenokarzinomen  dramatisch  reduziert.  Interessanterweise  zeigte  die  Färbung  für  TMIGD1  eine  Korrelation  zwischen  dem  Grad  der  zellulären  Differenzierung,  wobei  die  Expression  in  schwach  differenzierten gänzlich Neoplasma fehlte. Daher könnte TMIGD1 ein neuer Marker  für die epitheliale Differenzierung im unteren Margen‐Darm‐Traks und in der Niere  angesehen  werden.  Die  Auswirkungen  der  Runterregulierung  während  der  zellulären Entartung während Darmkrebsentwicklung werden Gegenstand weiterer  Untersuchungen sein.   



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Jiricny Josef, Verrey François
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:12 Feb 2010 14:54
Last Modified:08 Feb 2019 14:53
Number of Pages:0
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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