Abstract
RecQ DNA helicases are involved in processing of complex DNA structures arising during DNA metabolism to prevent aberrant mitotic recombination. Inherited defects in three of the five human RecQ helicases give rise to cancer predisposition syndromes. RECQ5 has not been associated with human disease. However, deletion of the Recq5 gene in mice results in cancer susceptibility. How RECQ5 could act as a tumor suppressor is not yet clear. Recent findings suggest that RECQ5 has a role in DNA replication and homologous recombination. RECQ5 associates with the replication machinery and accumulates at sites of stalled replication forks and DNA double-strand breaks. In addition, RECQ5 interacts physically with the RAD51 recombinase and possesses the ability to disrupt RAD51 presynaptic filaments. In a first study, we analyzed the activity of RECQ5 helicase on DNA structures that resemble stalled replication forks. RECQ5 was found to convert M13-based forked DNA substrates with a long leading-strand gap into four-way junctions as revealed by restriction-enzyme digestion of the reaction products. However, these structures were not sensitive to cleavage by the Holliday-junction resolvase RusA. These controversial findings and the observed low extent of RECQ5-promoted fork-regression reaction argue against a role for RECQ5 in the repair of stalled replication forks by template switching. In a second study, we explored the mechanism underlying RECQ5- mediated disruption of RAD51 presynaptic filaments. We investigated whether the observed physical interaction between RECQ5 and RAD51 is required for RECQ5-mediated displacement of RAD51 from ssDNA. To do so, we mapped precisely the RAD51-interaction site on RECQ5 and tested RECQ5 mutants that fail to interact with RAD51 for the ability to displace RAD51 from ssDNA in a topoisomerase-linked RAD51-trap assay. We found that direct RAD51 binding enhances the RAD51 filament-disruption activity of RECQ5 but it is not essential for it. In addition, we found that the helicase core fragment of RECQ5 was not able to displace RAD51 from ssDNA, suggesting a mechanistic difference between DNA unwinding and protein-DNA complex- disruption activity of RECQ5.
ZUSAMMENFASSUNG
RecQ DNA Helikasen sind in die Verarbeitung von komplexen DNA Strukturen involviert, die während dem DNA Metabolismus entstehen und verhindern unangemessene mitotische Rekombination. Vererbte Gendefekte in drei der fünf humanen RecQ Helikasen verursachen Krebsprädispositions-Syndrome. RECQ5 ist nicht assoziiert mit einer Erkrankung beim Menschen. Ein inaktiviertes Recq5 Gen in der Maus verursacht hingegen eine Disposition für Krebserkankungen. Wie RECQ5 als Tumorsuppressor agiern könnte, ist bis jetzt nicht klar. Neuere Daten weisen auf eine Funktion von RECQ5 in der DNA Replikation und homologer Rekombination hin. RECQ5 ist assoziiert mit der Replikationsmaschinerie und akkumuliert an blockierten Replikationsgabeln und DNA Doppelstrangbrüchen. Zusätzlich interagiert RECQ5 direkt mit der RAD51 Rekombinase und besitzt die Fähigkeit präsynaptische RAD51 Filamente zu zerlegen. Im ersten Teil der Studie untersuchten wir die RECQ5 Helikase Aktivität auf M13-basierten DNA Strukturen, die blockierten Replikationsgabeln glichen. Durch Restriktionsenzym-Verdau der Reaktionsprodukte wurde sichtbar gemacht, dass RECQ5 gabelförmige DNA Substrate mit einer grossen Lücke im Folgestrang in kreuzförmige DNA Strukturen umwandeln konnte. Diese Strukturen wurden aber nicht vom Holliday-Struktur spezifischen Enzym RusA geschnitten. Diese kontroversen Ergebnisse und das geringe Ausmass der Regressionsreaktion katalysiert durch RECQ5 sprechen gegen eine Funktion von RECQ5 in der Reparatur von blockierten Replikationsgabeln durch einen Matrizenwechsel-Mechanismus. Im zweiten Teil dieser Studie untersuchten wir den Mechanismus durch den RECQ5 präsynaptische RAD51 Filamente zerlegt. Wir untersuchten, ob die beobachtete direkte Interaktion zwischen RAD51 und RECQ5 dazu notwendig ist. Dafür kartierten wir die präzise Interaktionsstelle von RAD51 auf RECQ5. RECQ5 Mutanten, die nicht mit RAD51 interagieren konnten, wurden dann in einem Topoisomerase-basierten RAD51 Assay getestet auf ihre Fähigkeit RAD51 von einzelsträngiger DNA zu entfernen. Wir konnten zeigen, dass direkte RAD51-RECQ5 Interaktion stimulierend auf das Entfernen von RAD51 Filamenten durch RECQ5 wirkt, aber nicht notwendig dafür ist. Zusätzlich beobachteten wir, dass das Helikase-core Fragment von RECQ5 nicht in der Lage war RAD51 von einzelsträngiger DNA zu entfernen, was auf einen mechanistischen Unterschied zwischen dem Entwinden von DNA und dem Entfernen von an DNA gebundene Proteine durch RECQ5 hindeutet.
Schwendener, Sybille