Abstract
Proteins belonging to the RecQ DNA helicase family are highly conserved from bacteria to man and are implicated in removing aberrant DNA structures arising during DNA replication and repair to prevent inappropriate DNA recombination events. While E.coli and yeast have only one RecQ-type helicase, humans have five of these named RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 and RECQ5. Inherited defects in the genes encoding for BLM, WRN and RECQ4 have been found to give rise to Bloomʼs, Wernerʼs and Rothmund-Thomson syndrome, respectively. These severe recessive disorders are associated with genomic instability, cancer predisposition and premature aging. Association of inherited defects in the RECQ1 and RECQ5 genes with human disease has not been reported. However, knockout studies in chicken DT40 cells and in mice suggested that these genes function as tumor suppressors through enforcing chromosomal stability. A numerous biochemical and cellular studies indicated that the multiple RecQ homologues in human cells have non-redundant biological roles. However, the exact DNA transactions mediated by these proteins remain elusive.
The goal of this thesis was to advance our understanding of the cellular functions of RECQ5 and WRN helicases. In the first project (Kanagaraj et al., 2006), we explored the possible role for RECQ5 in replication fork management. Earlier biochemical studies from our group have shown that RECQ5 functions as a 3ʼ-5ʼ DNA helicase and it has also an ability to promote DNA strand annealing. We analyzed the action of RECQ5 on various synthetic forked DNA structures containing either heterologous or homologous arms. We found that the mode of action of RECQ5 helicase on these structures was different as compared to other human RecQ helicases. For example, we found that on forked structures with heterologous arms, RECQ5 showed preference for unwinding of the lagging-strand arm, whereas BLM and WRN helicases displayed a strong preference for unwinding of the parental arm. We also showed that RECQ5 promoted strand exchange between homologous arms of a synthetic forked DNA structure in a reaction dependent on ATP hydrolysis and that human replication protein A (hRPA) stimulated this reaction. Further, we identified a domain located in the non-conserved C- terminal portion of RECQ5 (a region spanning amino acids 561-651) as being important for its ability to unwind the lagging-strand arm of the fork and to promote strand exchange on hRPA-coated forked structures. Our cellular studies revealed that RECQ5 was associated with the DNA replication factories in S phase nuclei and persisted at the sites of stalled replication forks after exposure of cells to UV irradiation and cisplatin. Moreover, RECQ5 was found to physically interact with the polymerase processivity factor proliferating cell nuclear antigen in vitro and in vivo. Taken together, our findings suggested that RECQ5 might be involved in the reactivation of stalled replication forks.
In contrast to the other human RecQ homologues, RECQ5 exists in at least three different isoforms (named RECQ5α, RECQ5β and RECQ5γ) that result from alternative mRNA splicing. Although the RECQ5β isoform has been biochemically well characterized, no information was available for the other two isoforms. In the second project, we studied the biochemical properties of the two uncharacterized isoforms of RECQ5 in collaboration with Dr. Xiʼs laboratory (Ren et al., 2008). This work clarified the function of the zinc (Zn2+)-binding motif that is present in the RECQ5β protein but not in the other two short isoforms. Our initial studies have shown that the short RECQ5 isoforms, RECQ5α and RECQ5γ, containing all conserved helicase motifs do not possess ATPase and DNA unwinding activities. Additional biochemical experiments with the RECQ5α protein revealed that this RECQ5 isoform was proficient in DNA strand annealing. Surprisingly, a fragment of RECQ5β (1-475 aa) containing an intact Zn2+- binding motif did not exhibit any strand-annealing activity and was proficient in DNA unwinding. Further, our results demonstrated that Zn2+-binding motif of the human RECQ5β protein negatively regulates the intrinsic DNA strand-annealing activity of the helicase domain and is essential for the ATPase and helicase activities of the enzyme. Moreover, quantitative kinetic measurements indicated that the regulatory role of the Zn2+-binding motif was achieved by enhancing the DNA binding affinity of the enzyme. Taking into consideration that Zn2+-binding motif is highly conserved among RecQ family DNA helicases, we believe that the novel intra-molecular regulation of RECQ5 catalytic activity mediated by the Zn2+-binding motif (identified in this work) may represent a universal regulation mode for all RecQ family helicases. To further explore the biological role of the human RECQ5 helicase, we employed a proteomic approach to identify proteins associated with RECQ5 in vivo. One of the RECQ5 binding partners we found in this analysis was the MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) complex, a nuclease that functions in many aspects of DNA metabolism including DNA double-strand breaks (DSBs). Accumulating evidence suggest that the MRN nuclease acts as a DSB sensor and activates the ATM-signalling pathway. Accordingly, defects in the genes encoding for the components of the MRN complex lead to severe DNA damage sensitivity, high genomic instability, shortening of telomeres and aberrant meiosis. In the third project (Zheng et al., manuscript to be submitted), we investigated the biological significance of the association of RECQ5 with the MRN complex. We have demonstrated that RECQ5 binds directly to the MRE11 and NBS1 subunits of the MRN complex. The MRN complex and RECQ5 were found to co-localize at sites of stalled DNA replication forks and sites of DNA DSBs. Further, we showed that the MRN complex is required for the recruitment of RECQ5 to the sites of DNA damage. In addition, our biochemical experiments revealed that RECQ5 negatively regulates the MRN complex by attenuating its 3ʼ-5ʼ exonuclease activity. Collectively, these data establish a functional relationship between RECQ5 and the MRN complex in the cellular response to DNA damage.
In the last project, we characterized the interaction between the Werner syndrome protein (WRN) and the mismatch repair (MMR) initiation factors (Saydam et al., 2007). The MMR system maintains genomic integrity by correcting DNA replication errors and preventing recombination between divergent sequences. Werner syndrome (WS) is a severe recessive disorder characterized by premature aging, cancer predisposition and genomic instability. The gene mutated in WS encodes a bi-functional enzyme called WRN that acts as a 3ʼ-5ʼ DNA helicase and a 3 -5 exonuclease, but its exact role in DNA metabolism is poorly understood. We found that WRN physically interacts with the MMR initiation factors, MutSα (heterodimer of MSH2/MSH6), MutSβ (heterodimer of MSH2/MSH3) and MutLα (heterodimer of MLH1/PMS2). Also, we found that the helicase activity of WRN on forked DNA structures containing a 3ʼ-single-stranded arm was strongly stimulated by MutSα or MutSβ, but not by MutLα. Moreover, the stimulatory effect of MutSα on WRN-mediated unwinding was enhanced by presence of a G/T mismatch in the DNA duplex ahead of the fork. Collectively, these data are consistent with results of genetic experiments conducted in yeast suggesting that MMR factors act in conjunction with a RecQ-type helicase to reject recombination between divergent sequences.
Proteine, die zur RecQ DNA Helikase Familie gehören, sind hoch konserviert vom Bakterium bis hin zum Menschen. RecQ Helikasen werden zum Entfernen von ungewöhnlicher DNA Strukturen benötigt, die während der DNA Replikation und Reparatur entstehen und verhindern daher eine übermässige DNA Rekombination (Bachrati & Hickson, 2003). Während E.coli und Hefe nur eine RecQ Helikase haben, gibt es beim Menschen fünf Mitglieder dieser Proteine, nämlich RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 und RECQ5. Vererbte Defekte im BLM, WRN oder RECQ4 Gen werden in Patienten mit Bloom, Werner oder Rothmund-Thomson Syndrom gefunden. Dies sind schwere rezessive Erkrankungen, die mit genomischer Instabilität, Krebsprädisposition und beschleunigtem Alterungsprozess assoziiert sind. Vererbte Defekte im RECQ1 und RECQ5 Gen sind bis jetzt nicht in Verbindung gebracht worden mit Erkrankungen beim Menschen. Studien mit aviären DT40 knock-out Zellen und in Mäusen deuten jedoch darauf hin, dass diese Gene auch als Tumorsuppressoren agieren und die chromosomale Stabilität erhöhen. Eine Anzahl biochemischer und zellulärer Studien zeigen auf, dass die mehrfachen RecQ Homologe in der humanen Zelle nicht redundante biologische Funktionen haben. Die exakte DNA Transaktion, die von diesen Proteinen vermittelt wird, bleibt hingegen ungewiss.
Das Ziel dieser Dissertation war die zelluläre Funktion der RECQ5 und WRN Helikase besser zu definieren. Im ersten Projekt (Kanagaraj et al., 2006), untersuchten wir die mögliche Funktion von RECQ5 an der Replikationsgabel. Frühere biochemische Studien in unserer Gruppe haben gezeigt, dass RECQ5 eine 3ʼ-5ʼ DNA Helikase ist und das Zusammenlegen von einzelsträngiger DNA beschleunigen kann. Wir analysierten die Aktivität von RECQ5 mit verschiedenen synthetischen gabelförmiger DNA Strukturen, die entweder heterologe oder homologe Arme hatten. Wir fanden andere Aktivitätsmuster bei RECQ5 als bei anderen humanen RecQ Helikasen. Zum Beispiel zeigte RECQ5 eine Präferenz den Folgestrang zu entwinden, bei einer gabelförmiger Duplex-DNA mit heterologen Armen, während BLM und WRN Helikasen eine strarke Präferenz aufwiesen den parentalen Arm zu entwinden. Wir zeigten auch, dass RECQ5 eine Strangaustausch-Reaktion zwischen den homologen Armen einer synthetischen gabelförmigen DNA Struktur katalysiert. Diese Reaktion war abhängig von ATP Hydrolyse und wurde stimuliert durch das humane Replikationsprotein (hRPA). Wir identifizierten weiter eine Domäne im nicht konservierten C-terminalen Bereich von RECQ5 (umfasst Aminosäuren 561 -651), die wichtig ist für das Entwinden des Folgestrangarms und die Strangaustausch-Reaktion an einer gabelförmigen Struktur mit gebundenem hRPA. Unsere Zellkulturexperimente zeigten auf, dass RECQ5 mit der DNA Replikationsmaschinerie im S-Phasenkern assoziiert ist und nach UV-Exposition und Cisplatin-Behandlung an Stellen mit blockierten Replikationsgabeln gebunden bleibt. Wir fanden zusätzlich eine direkte Interaktion zwischen RECQ5 und dem proliferating cell nuclear antigen, dem Prozessivitätsfaktor der Polymerase, in vitro und in vivo. Zusammenfassend deuten unsere Resultate darauf hin, dass RECQ5 an der Reaktivierung von blockierten Replikationsgabeln beteiligt sein könnte.
Im Unterschied zu den anderen humanen RecQ Homologen, existiert RECQ5 in mindestens drei Isoformen (nämlich RECQ5α, RECQ5β und RECQ5γ), die durch alternatives mRNA Spleissen hervorgehen. Die RECQ5β Isoform ist biochemisch gut charakterisiert, über die beiden anderen Isoformen waren hingegen keine Informationen vorhanden. In einem zweiten Projekt studierten wir die biochemischen Eigenschaften dieser uncharakterisierten RECQ5 Isoformen in Kollaboration mit Dr. Xis Labor (Ren et al., 2008). In dieser Arbeit wurde die Funktion des Zink (Zn2+)-Bindungsmotifes aufgeklärt, das im RECQ5β Protein vorhanden ist, nicht aber in den beiden kurzen Isoformen. Unsere ersten Studien haben gezeigt, dass die kurzen RECQ5 Isoformen (RECQ5α und RECQ5γ), die alle konservierten Helikasemotife enthalten, keine ATPase und DNA-Entwindungs-Aktivität zeigen. Weitere biochemische Experimente mit RECQ5α zeigten, dass dieses Protein das Zusammenlegen von einzelsträngiger DNA katalysiert. Dieser Vorgang wurde erstaunlicherweise nicht beschleunigt vom RECQ5β Fragment (Aminosäure 1-475), das ein intaktes Zn2+-Bindungsmotif enthält und DNA- Duplex entwinden kann. Unsere Resultate zeigen auf, dass das Zn2+-Bindungsmotif des humanen RECQ5 Proteins die intrinsische Einzelstrangpaarungsaktivität der Helikasedomäne negativ reguliert und essentiell für die ATPase und Helikaseaktivität des Enzymes ist. Quantitative Kinetikmessungen zeigten weiter, dass die regulatorische Funktion des Zn2+-Bindungsmotifes durch Stimulierung der DNA-Bindungsaffinität erreicht wird. Da das Zn2+-Bindungsmotif unter RecQ DNA Helikasen hoch konserviert ist, glauben wir, dass die hier neu identifizierte intramolekulare Regulation der RECQ5 Aktivität durch dieses Motif auch bei andern Mitglieder der RecQ Proteinfamilie gefunden werden könnte und es sich hierbei um einen universalen Regulationsmechanismus handeln könnte.
Um die biologische Funktion der humanen RECQ5 Helikase weiter zu erforschen, führten wir eine Proteom-Analyse durch, mit dem Ziel Proteine, die in vivo mit RECQ5 assoziiert sind zu identifizieren. Ein identifizierter Bindungspartner ist der MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) Komplex, eine Nuklease, die in den DNA Metabolismus involviert ist, unter anderem auch in die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB). Mehrere Anhaltspunkte weisen darauf hin, dass die MRN Nuklease als DSB- Sensor funktioniert und den ATM Signalweg aktiviert. Defekte in den Genen, die für die Komponente des MRN Komplexes kodieren, führen erwartungsgemäss zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden, hohe genomische Instabilität, verkürzte Telomere und fehlerhafte Meiose. In einem dritten Projekt (Zheng et al., Manuskript noch nicht eingereicht) untersuchten wir die biologische Signifikanz von der RECQ5- MRN Interaktion. Wir konnten demonstrieren, dass RECQ5 die Untereinheiten des MRN Komplexes, MRE11 und NBS1, direkt bindet. Der MRN Komplex und RECQ5 konnten an Stellen von blockierten DNA Replikationsgabeln und DNA DSB co-lokalisiert werden. Wir zeigten weiter, dass der MRN Komplex erforderlich ist, um RECQ5 zu den DNA Schäden zu rekrutieren. In unseren biochemischen Experimenten konnten wir zusätzlich zeigen, dass RECQ5 den MRN Komplex negativ reguliert, indem die 3ʼ-5ʼ Exonukleaseaktivität des MRN Komplexes abgeschwächt wird. Diese Daten weisen auf eine funktionelle Beziehung zwischen RECQ5 und dem MRN Komplex in der zellulären Antwort auf DNA Schäden hin. In einem letzen Projekt (Saydam et al., 2007) charakterisierten wir die Interaktion zwischen dem Werner Syndrom Protein (WRN) und den Mismatch- Reparatur (MMR) Initiationsfaktoren. Das MMR System trägt zur genomischen Integrität bei, indem es DNA Replikationsfehler korrigiert und Rekombination zwischen abweichenden Sequenzen verhindert. Werner Syndrom (WS) ist eine schwere rezessive Erkrankung, die durch einen beschleunigten Alterungsprozess, Krebsprädisposition und genomische Instabilität charakterisiert ist. Das Gen, das im WS mutiert ist, kodiert für ein bifunktionelles Enzym WRN, das als 3ʼ-5ʼ DNA Helikase und 3ʼ-5ʼ Exonuklease agiert. Die exakte Funktion von WRN im DNA Metabolismus wird bis jetzt nur unvollständig verstanden. Wir fanden eine direkte Interaktion zwischen WRN und den MMR Initiationsfaktoren MutSα (Heterodimer zwischen MSH2/MSH6), MutSβ (Heterodimer zwischen MSH2/MSH3) und MutLα (Heterodimer zwischen MLH1/PMS2). Wir konnten auch zeigen, dass die Helikaseaktivität von WRN an einer gabelförmigen DNA Struktur mit einem 3ʼ-einzelsträngigen Arm stark stimuliert wird durch MutSα oder MutSβ, nicht aber durch MutLα. Ausserdem wird der stimulatorische Effekt von MutSα auf die WRN Helikaseaktivität durch G/T Mismatch in der DNA Duplex vor der Replikationsgabel verstärkt. Insgesamt stimmen diese Daten mit genetischen Experimenten in Hefe überein und deuten darauf hin, dass MMR Faktoren gemeinsam mit RecQ Helikasen funktionieren, um die Rekombination zwischen abweichenden Sequenzen zu verhindern.
Radhakrishnan, Kanagaraj