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Identification of membrane proteins involved in heavy metal detoxification and transport in Arabidopsis thaliana


Sudre, Damien. Identification of membrane proteins involved in heavy metal detoxification and transport in Arabidopsis thaliana. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary

Cadmium (Cd2+) is a highly toxic metal classified as human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. Cadmium is widespread in the environment and considered a major pollutant. In most plants Cd2+ accumulation leads to toxicity syndroms, resulting, among others, in chlorosis, perturbation of essential metal homeostasis (Cu2+, Zn2+, Mn2+, and Fe2+), protein damage, inhibition of some enzyme activities and lipid peroxidation. Therefore research on cadmium has often pursues: on one hand the aim is to learn more about cadmium stress, transport and detoxification, and on the other hand it is believed that in most if not all of the cases cadmium enters the cell and is distributed within the plant via transporters with affinities for other divalent cations. Therefore research on cadmium often leads to the identification of new transporters and others proteins participating in the homeostasis of other micronutrients. In order to identify new transporters involved in cadmium uptake and redistribution we manufactured a custom-made chip on which all ABC transporters and other membrane proteins of A. thaliana were spotted. Treatment with cadmium revealed that several of these genes were upregulated by cadmium. Among them where three candidate genes which were analyzed in more detail within the frame of this PhD thesis. The first gene investigated was AtOSA1, (Arabidopsis thaliana Oxidative Stress related Abc1like protein). AtOSA1 belongs to the family of Abc1 proteins. Abc1-like proteins have been identified in prokaryotes and in the mitochondria of eukaryotes. AtOSA1localized to the chloroplast envelope and therefore constitutes the first report on a member of this family to be localized in the plastid. However, despite sharing homology to the mitochondrial ABC1of Saccharomyces cerevisiae, AtOSA1 was not able to complement yeast strains deleted in the endogenous Abc1 gene, thereby suggesting different functions between AtOSA1 and yeast ABC1. Compared to the wild-type plants, AtOSA1 T-DNA-insertion mutants accumulated less Cd in leaves but nevertheless showed a more pronounced chlorotic phenotype when exposed to Cd. atosa1 mutants also exhibited an increased sensitivity towards oxidative stress and light. Furthermore, they displayed constitutively higher superoxide dismutase activities. Sequence analysis predicted that AtOSA1contains a putative kinase domain. In gel protein kinase assays using myelin basic protein as a kinase substrate revealed that, compared to the wild type, chloroplast envelope membrane fractions from the Atosa1 mutant lacked a 70 kD phosphorylated protein. Our data suggest that the chloroplast AtOSA1is involved in reactive oxygen sensing and could participate in controlled long distance transport of Cd from the root to the shoot. Based on the same transcriptomic analysis, we also found two ABC transporters, AtATH12 and AtPDR1, whose gene expression were altered by cadmium. ABC (ATP Binding Cassette) transporters constitute one of the largest families of proteins in living organisms present in all kingdoms. ABC proteins are involved in the transport of a wide variety of substances, including ions, carbohydrates, lipids, xenobiotics, antibiotics, drugs and heavy metals. The analysis of gene expression in Arabidopsis thaliana using cDNA-microarrays and RT-PCR showed that AtATH12 transcript levels are induced by Cd2+ treatment. To investigate the role of the half size ABC transporter AtATH12, we first verified its predicted plastidic localization using an AtATH12-YFP fusion protein which was driven by the CaMV35S promoter. In order to demonstrate that AtATH12 is indeed involved in cadmium transport, we performed drop test analysis by complementing a cadmium sensitive yeast strain (YMK2) with AtATH12, which did or did not contain the chloroplastic transit peptide. These results showed that AtATH12 could partially complement the cadmium sensitive phenotype when expressed without the targeting sequence. Additionally, determination of metal contents in AtATH12 transformed yeasts cells revealed that these cells accumulated significantly less Cd and Fe compared to the empty vector control, suggesting that AtATH12 may act as a Cd and Fe exporter. atath12 T-DNA insertion mutants were more affected by Cd2+ than wild type plants. When grown hydroponically, leaves from wild-type Arabidopsis plants accumulated more cadmium than atath12 and the mutant exhibited a marked chlorotic phenotype when exposed to 0.5 µM CdCl for 2

7 days. A similar phenotype was observed in Fe-deficiency condition. Ferritin is the major form of iron storage in the chloroplast with one ferritin molecule capable of storaging up to 4000 iron atoms. To investigate whether iron homeostasis is disturbed in the chloroplast we performed a Western blot analysis on one-week-old seedlings grown on 1/2 MS or on iron-free agar plates and observed that atath12 mutants contained considerably more ferritin. Together these results strongly suggest that the chloroplast localized AtATH12 is involved in iron and cadmium export from the chloroplast to the cytosol.



Cadmium (Cd2+) ist ein hoch toxisches Metall, welches von der „International Agency for Research on Cancer“ als carzinogen fuer Menschen eingestuft wird. Cadmium ist weit verbreitet und zaehlt zu einem der groessten Umweltgifte. Cd2+-Akkumulation in Pflanzen fuehrt zu Vergiftungserscheinungen wie Chlorose, Stoerungen der Homöostase essentieller Metalle (Cu2+, Zn2+, Mn2+ und Fe2+), Schaedigung von Proteinen, Beeintraechtigung bestimmter Enzymaktivitaeten und Lipid-Peroxidierung. Die Wissenschaft, welche sich mit den Effekten von Cadmium befasst, verfolgt oft zwei Ziele: Zum einem geht es darum mehr ueber cadmiuminduzierten Stress, Cadmiumtransport und Cadmiumentgiftung in Erfahrung zu bringen. Zum anderem wird angenommen, dass sowohl die Aufnahme als auch die Verteilung von Cadmium innerhalb der Pflanze fast ausschliesslich von Transportern mit hohen Affinitaeten fuer andere divalente Kationen bewerkstelligt wird. Deshalb fuehrt die Cadmium-Forschung oft zur Entdeckung von neuen Transportern und anderen Proteinen, welche an der Homöostase anderer Mikroelemente beteiligt sind. Mit dem Ziel neue Transporter zu identifizieren, die bei der Aufnahme von Cadmium eine Rolle spielen, entwickelten wir einen Micro-array Chip, auf welchem alle ABC-Transporter sowie andere Membranproteine von A. thaliana enthalten sind. Die Behandlung von Pflanzen mit Cadmium zeigte, das einige der entsprechenden Gene durch Cadmium positiv transkriptionell reguliert werden. Von diesen wurden drei Kandidatengene im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit im Detail analysiert. Als erstes Gen wurde AtOSA1 (Arabidopsis thaliana Oxidative Stress related Abc1like protein) charakterisiert. AtOSA1 gehoert zur Familie der Abc1 Proteine. Abc1 aehnliche Proteine sind von Prokaryoten und aus den Mitochondrien von Eukaryoten bekannt. AtOSA1 allerdings wurde im Envelope des Chloroplasten lokalisiert und ist damit das erste Mitglied dieser Proteinfamilie mit Sitz im Plastiden. Trotz hoher Aehnlichkeit/Homologie zum mitochondrialen ABC1 von Saccharomyces cerevisiae, war es nicht moeglich Hefestaemme ohne funktionellen ABC1mit AtOSA1zu komplementieren, was darauf hindeutete, dass AtOSA1und ABC1aus Hefe unterschiedliche Funktionen erfuellen. Im Vergleich zum Wildtyp akkumulierten AtOSA1 T-DNA Insertionsmutanten weniger Cadmium in Blaettern, zeigten aber dennoch einen staerkeren chlorotischen Phaenotyp in Gegenwart von Cadmium. atosa1 Mutanten waren ausserdem anfaelliger gegenueber oxidativem Stress sowie Hochlicht und verfuegten ueber eine konstitutiv hoehere Superoxid-Dismutase Aktivitaet. Sequenzanalysen lassen darauf schliessen, dass AtOSA1 eine putative Kinasedomaene besitzt. In gelo Proteinkinase Assays mit Myelin-Basic-Protein als Kinasesubstrat konnten zeigen, dass im Envelope der Chloroplasten von atosa1-Mutanten ein 70 kD grosses phosphoryliertes Protein fehlt. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das chloroplasdidaere AtOSA1 beim Dedektieren von reaktiven Sauerstoff beteiligt ist und eine Rolle beim Ferntransport von Cadmium von Wurzel nach Spross spielen koennte. Basierend auf derselben Transkriptionsanalyse wurden ausserdem zwei ABC-Transporter, AtATH12 und AtPDR2, gefunden, deren Expression durch die Applikation von Cadmium veraendert wurde. ABC (ATP-Binding-Cassette) Transporter bilden eine der groessten bekannten Proteinfamilien, mit Representanten in Bakterien, Pilzen, Tieren und Pflanzen. ABC-Proteine sind beim Transport einer Vielzahl von Substanzen beteiligt, unter anderen Ionen, Carbohydraten, Lipiden, Xenobiotika, Antibiotika, Pharmazeutika/Artzneimittel und Schwermetalle. Die Analyse der Genexpression in Arabidopsis thaliana mit Hilfe von cDNA-Microarrays und RT-PCR konnte zeigen, dass AtATH12 Transkriptlevel durch Cd2+ induziert werden. Um die Funktion des „half-size“ ABC-Transporters AtATH12 genauer zu untersüchten, wurde zunaechst seine vorrausgesagte chloroplastidaere Lokalisation durch ein AtATH12-YFP Fusionsprotein unter der Kontrolle des CaMV35S-Promoters bestaetigt. Um weiterhin zu verifizieren, dass AtATH12 in der Tat Cadmium transportiert, komplementierten wir einen cadmiumsensitiven Hefestamm (YMK2) mit AtATH12 mit und ohne das chloroplastidaere Transitpeptid. Drop-Test Assays konnten zeigen, dass AtATH12 ohne die „Targeting“-Sequenz die Cadmiumsensitivitüt teilweise komplementieren kann. Ausserdem liess eine Quantifizierung der Metallgehalte in AtATH12-transformierten Hefezellen erkennen, dass diese, im Vergleich zur Vektorkontrolle, signifikant weniger Cadmium und Eisen akkumulierten, was darauf hindeutet, dass AtATH12 als ein Cadmium- und Eisenexporter fungiert. atath12 T-DNA-Insertionsmutanten waren gegenueber Cd2+ sensitiver als Wildtyp-Pflanzen. Unter hydroponischen Wachstumsbedingungen nahmen Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen mehr Cd2+ in ihre Bleatter auf als atath12 und die Mutante entwickelte einen markanten chlorotischen Phaenotyp wenn sie fuer 7 Tage einer 0.5 µM CdCl Loesung ausgesetzt wurde. Ein aehnlicher 2

Phaenotyp konnte unter eisenlimitierenden Bedingungen beobachtet werden. Ferretin ist eine der Hauptformen der Eisenlagerung in Chloroplasten, wobei ein Ferretin- Molekuel bis zu 4000 Eisenatome aufnehmen kann. Um zu ueberpruefen, ob die Eisenhomoostase in Chloroplasten gestoert ist, unternahmen wir eine Western-Blot Analyse an 7 Tage alten Keimlingen, welche entweder auf 1/2 MS oder auf eisenfreien Agarplatten angezogen wurden. Diese bestaetigte, dass atath12 Mutanten wesentlich weniger Ferretin enthalten. Zusammengenommen weisen die Resultate stark darauf hin, dass das chloroplastidaere AtATH12 am Export von Cadmium und Eisen aus Plastiden beteiligt ist.

Abstract

Summary

Cadmium (Cd2+) is a highly toxic metal classified as human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. Cadmium is widespread in the environment and considered a major pollutant. In most plants Cd2+ accumulation leads to toxicity syndroms, resulting, among others, in chlorosis, perturbation of essential metal homeostasis (Cu2+, Zn2+, Mn2+, and Fe2+), protein damage, inhibition of some enzyme activities and lipid peroxidation. Therefore research on cadmium has often pursues: on one hand the aim is to learn more about cadmium stress, transport and detoxification, and on the other hand it is believed that in most if not all of the cases cadmium enters the cell and is distributed within the plant via transporters with affinities for other divalent cations. Therefore research on cadmium often leads to the identification of new transporters and others proteins participating in the homeostasis of other micronutrients. In order to identify new transporters involved in cadmium uptake and redistribution we manufactured a custom-made chip on which all ABC transporters and other membrane proteins of A. thaliana were spotted. Treatment with cadmium revealed that several of these genes were upregulated by cadmium. Among them where three candidate genes which were analyzed in more detail within the frame of this PhD thesis. The first gene investigated was AtOSA1, (Arabidopsis thaliana Oxidative Stress related Abc1like protein). AtOSA1 belongs to the family of Abc1 proteins. Abc1-like proteins have been identified in prokaryotes and in the mitochondria of eukaryotes. AtOSA1localized to the chloroplast envelope and therefore constitutes the first report on a member of this family to be localized in the plastid. However, despite sharing homology to the mitochondrial ABC1of Saccharomyces cerevisiae, AtOSA1 was not able to complement yeast strains deleted in the endogenous Abc1 gene, thereby suggesting different functions between AtOSA1 and yeast ABC1. Compared to the wild-type plants, AtOSA1 T-DNA-insertion mutants accumulated less Cd in leaves but nevertheless showed a more pronounced chlorotic phenotype when exposed to Cd. atosa1 mutants also exhibited an increased sensitivity towards oxidative stress and light. Furthermore, they displayed constitutively higher superoxide dismutase activities. Sequence analysis predicted that AtOSA1contains a putative kinase domain. In gel protein kinase assays using myelin basic protein as a kinase substrate revealed that, compared to the wild type, chloroplast envelope membrane fractions from the Atosa1 mutant lacked a 70 kD phosphorylated protein. Our data suggest that the chloroplast AtOSA1is involved in reactive oxygen sensing and could participate in controlled long distance transport of Cd from the root to the shoot. Based on the same transcriptomic analysis, we also found two ABC transporters, AtATH12 and AtPDR1, whose gene expression were altered by cadmium. ABC (ATP Binding Cassette) transporters constitute one of the largest families of proteins in living organisms present in all kingdoms. ABC proteins are involved in the transport of a wide variety of substances, including ions, carbohydrates, lipids, xenobiotics, antibiotics, drugs and heavy metals. The analysis of gene expression in Arabidopsis thaliana using cDNA-microarrays and RT-PCR showed that AtATH12 transcript levels are induced by Cd2+ treatment. To investigate the role of the half size ABC transporter AtATH12, we first verified its predicted plastidic localization using an AtATH12-YFP fusion protein which was driven by the CaMV35S promoter. In order to demonstrate that AtATH12 is indeed involved in cadmium transport, we performed drop test analysis by complementing a cadmium sensitive yeast strain (YMK2) with AtATH12, which did or did not contain the chloroplastic transit peptide. These results showed that AtATH12 could partially complement the cadmium sensitive phenotype when expressed without the targeting sequence. Additionally, determination of metal contents in AtATH12 transformed yeasts cells revealed that these cells accumulated significantly less Cd and Fe compared to the empty vector control, suggesting that AtATH12 may act as a Cd and Fe exporter. atath12 T-DNA insertion mutants were more affected by Cd2+ than wild type plants. When grown hydroponically, leaves from wild-type Arabidopsis plants accumulated more cadmium than atath12 and the mutant exhibited a marked chlorotic phenotype when exposed to 0.5 µM CdCl for 2

7 days. A similar phenotype was observed in Fe-deficiency condition. Ferritin is the major form of iron storage in the chloroplast with one ferritin molecule capable of storaging up to 4000 iron atoms. To investigate whether iron homeostasis is disturbed in the chloroplast we performed a Western blot analysis on one-week-old seedlings grown on 1/2 MS or on iron-free agar plates and observed that atath12 mutants contained considerably more ferritin. Together these results strongly suggest that the chloroplast localized AtATH12 is involved in iron and cadmium export from the chloroplast to the cytosol.



Cadmium (Cd2+) ist ein hoch toxisches Metall, welches von der „International Agency for Research on Cancer“ als carzinogen fuer Menschen eingestuft wird. Cadmium ist weit verbreitet und zaehlt zu einem der groessten Umweltgifte. Cd2+-Akkumulation in Pflanzen fuehrt zu Vergiftungserscheinungen wie Chlorose, Stoerungen der Homöostase essentieller Metalle (Cu2+, Zn2+, Mn2+ und Fe2+), Schaedigung von Proteinen, Beeintraechtigung bestimmter Enzymaktivitaeten und Lipid-Peroxidierung. Die Wissenschaft, welche sich mit den Effekten von Cadmium befasst, verfolgt oft zwei Ziele: Zum einem geht es darum mehr ueber cadmiuminduzierten Stress, Cadmiumtransport und Cadmiumentgiftung in Erfahrung zu bringen. Zum anderem wird angenommen, dass sowohl die Aufnahme als auch die Verteilung von Cadmium innerhalb der Pflanze fast ausschliesslich von Transportern mit hohen Affinitaeten fuer andere divalente Kationen bewerkstelligt wird. Deshalb fuehrt die Cadmium-Forschung oft zur Entdeckung von neuen Transportern und anderen Proteinen, welche an der Homöostase anderer Mikroelemente beteiligt sind. Mit dem Ziel neue Transporter zu identifizieren, die bei der Aufnahme von Cadmium eine Rolle spielen, entwickelten wir einen Micro-array Chip, auf welchem alle ABC-Transporter sowie andere Membranproteine von A. thaliana enthalten sind. Die Behandlung von Pflanzen mit Cadmium zeigte, das einige der entsprechenden Gene durch Cadmium positiv transkriptionell reguliert werden. Von diesen wurden drei Kandidatengene im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit im Detail analysiert. Als erstes Gen wurde AtOSA1 (Arabidopsis thaliana Oxidative Stress related Abc1like protein) charakterisiert. AtOSA1 gehoert zur Familie der Abc1 Proteine. Abc1 aehnliche Proteine sind von Prokaryoten und aus den Mitochondrien von Eukaryoten bekannt. AtOSA1 allerdings wurde im Envelope des Chloroplasten lokalisiert und ist damit das erste Mitglied dieser Proteinfamilie mit Sitz im Plastiden. Trotz hoher Aehnlichkeit/Homologie zum mitochondrialen ABC1 von Saccharomyces cerevisiae, war es nicht moeglich Hefestaemme ohne funktionellen ABC1mit AtOSA1zu komplementieren, was darauf hindeutete, dass AtOSA1und ABC1aus Hefe unterschiedliche Funktionen erfuellen. Im Vergleich zum Wildtyp akkumulierten AtOSA1 T-DNA Insertionsmutanten weniger Cadmium in Blaettern, zeigten aber dennoch einen staerkeren chlorotischen Phaenotyp in Gegenwart von Cadmium. atosa1 Mutanten waren ausserdem anfaelliger gegenueber oxidativem Stress sowie Hochlicht und verfuegten ueber eine konstitutiv hoehere Superoxid-Dismutase Aktivitaet. Sequenzanalysen lassen darauf schliessen, dass AtOSA1 eine putative Kinasedomaene besitzt. In gelo Proteinkinase Assays mit Myelin-Basic-Protein als Kinasesubstrat konnten zeigen, dass im Envelope der Chloroplasten von atosa1-Mutanten ein 70 kD grosses phosphoryliertes Protein fehlt. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das chloroplasdidaere AtOSA1 beim Dedektieren von reaktiven Sauerstoff beteiligt ist und eine Rolle beim Ferntransport von Cadmium von Wurzel nach Spross spielen koennte. Basierend auf derselben Transkriptionsanalyse wurden ausserdem zwei ABC-Transporter, AtATH12 und AtPDR2, gefunden, deren Expression durch die Applikation von Cadmium veraendert wurde. ABC (ATP-Binding-Cassette) Transporter bilden eine der groessten bekannten Proteinfamilien, mit Representanten in Bakterien, Pilzen, Tieren und Pflanzen. ABC-Proteine sind beim Transport einer Vielzahl von Substanzen beteiligt, unter anderen Ionen, Carbohydraten, Lipiden, Xenobiotika, Antibiotika, Pharmazeutika/Artzneimittel und Schwermetalle. Die Analyse der Genexpression in Arabidopsis thaliana mit Hilfe von cDNA-Microarrays und RT-PCR konnte zeigen, dass AtATH12 Transkriptlevel durch Cd2+ induziert werden. Um die Funktion des „half-size“ ABC-Transporters AtATH12 genauer zu untersüchten, wurde zunaechst seine vorrausgesagte chloroplastidaere Lokalisation durch ein AtATH12-YFP Fusionsprotein unter der Kontrolle des CaMV35S-Promoters bestaetigt. Um weiterhin zu verifizieren, dass AtATH12 in der Tat Cadmium transportiert, komplementierten wir einen cadmiumsensitiven Hefestamm (YMK2) mit AtATH12 mit und ohne das chloroplastidaere Transitpeptid. Drop-Test Assays konnten zeigen, dass AtATH12 ohne die „Targeting“-Sequenz die Cadmiumsensitivitüt teilweise komplementieren kann. Ausserdem liess eine Quantifizierung der Metallgehalte in AtATH12-transformierten Hefezellen erkennen, dass diese, im Vergleich zur Vektorkontrolle, signifikant weniger Cadmium und Eisen akkumulierten, was darauf hindeutet, dass AtATH12 als ein Cadmium- und Eisenexporter fungiert. atath12 T-DNA-Insertionsmutanten waren gegenueber Cd2+ sensitiver als Wildtyp-Pflanzen. Unter hydroponischen Wachstumsbedingungen nahmen Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen mehr Cd2+ in ihre Bleatter auf als atath12 und die Mutante entwickelte einen markanten chlorotischen Phaenotyp wenn sie fuer 7 Tage einer 0.5 µM CdCl Loesung ausgesetzt wurde. Ein aehnlicher 2

Phaenotyp konnte unter eisenlimitierenden Bedingungen beobachtet werden. Ferretin ist eine der Hauptformen der Eisenlagerung in Chloroplasten, wobei ein Ferretin- Molekuel bis zu 4000 Eisenatome aufnehmen kann. Um zu ueberpruefen, ob die Eisenhomoostase in Chloroplasten gestoert ist, unternahmen wir eine Western-Blot Analyse an 7 Tage alten Keimlingen, welche entweder auf 1/2 MS oder auf eisenfreien Agarplatten angezogen wurden. Diese bestaetigte, dass atath12 Mutanten wesentlich weniger Ferretin enthalten. Zusammengenommen weisen die Resultate stark darauf hin, dass das chloroplastidaere AtATH12 am Export von Cadmium und Eisen aus Plastiden beteiligt ist.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Martinoia Enrico
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:580 Plants (Botany)
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:18 Feb 2010 18:55
Last Modified:24 Sep 2019 16:43
Number of Pages:114
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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