Abstract
One important focus of aquatic microbial ecology lies on the spatial and temporal dynamics of bacterial populations in freshwater and marine systems, as well as on the structure of communities in terms of phylogenetic composition and activity distribution. These questions can be accurately and comprehensively addressed through the investigation of single cells by in-situ staining techniques and subsequent analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. A variety of staining protocols are available to assess abundances, phylogenetic identity and activities on a single-cell level. However, while biological preparations can be produced massively parallel, the manual microscopic cell counting and sizing represents the bottleneck of this approach and limits the scope of experimental studies. The main objective of my Ph.D. thesis was to design and establish a fully automated microscopy platform for autonomous image acquisition and analysis of multiple stained microbial cells. This was realized on a commercial microscope by means of object-oriented programming and the elaboration of a suitable workflow. The system was subsequently applied for the investigation of bacterioplankton dynamics during phytoplankton spring blooms in Lake Zürich and in other field studies. Particular emphasis was put on basic methodological problems arising in high throughput screening by epifluorescence microscopy in the context of aquatic microbial ecology. For one, a fast and accurate autofocus routine based on live image processing and image subdivision was created. It is able to measure the topology of fields of view to assess image quality prior to image acquisition. Nevertheless, additional post-acquisition image quality control was found to be of crucial importance for data precision in high throughput imaging. An automated image quality assessment routine based on artificial neural network analysis was established to efficiently process large image datasets. Thirdly, a contour-based, morphology independent algorithm was developed to accurately assess biovolumes of aquatic microbes, because it represents an ecologically important feature that can be readily retrieved by microscopy and image analysis. Currently applied methods were found to be over-simplistic and moreover strongly biased for some bacterial cell morphologies. A final project was focused on Planktothrix rubescens, an important constituent of the autotrophic bacterioplankton in many lakes (including Lake Zürich). Since its filamentous morphology and its large size complicate automated quantification and size measurement by conventional image processing, an object-oriented model based image analysis approach was developed for this purpose.
Zusammenfassung
Die Untersuchung von bakteriellen Population im Süsswasser sowie im marinen Plankton ist ein wichtiger Schwerpunkt der aquatischen mikrobiellen Ökologie. In diesem Zusammenhang sind die zeitlichen und räumlichen Dynamiken von Populationen sowie die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft im Bezug auf ihre phylogenetische Zusammensetzung und ihre Aktivitätsmuster von grossem Interesse. Als Mittel zur Untersuchung dieser Fragestellungen ist im Besonderen die fluoreszenzmikroskopische Analyse einzelner Zellen oder die Durchflusszytometrie geeignet. Zur Bestimmung von Abundanzen, taxonomischer Zugehörigkeit und Aktivitätslevel von einzelnen Zellen steht eine Vielfalt von etablierten Färbeprotokollen zur Verfügung. Die Produktion von biologischen Präparaten lässt sich in grossem Masse parallel realisieren, die Auswertung hingegen erfolgt generell durch manuelles Mikroskopieren, ist daher sehr zeitaufwändig und stellt den limitierenden Faktor für den Umfang von experimentellen Studien dar. Das Ziel dieser Doktorarbeit war das Konzipieren und Entwickeln einer automatischen Mikroskopie-Platform für die vollautomatische Auswertung von biologischen Präparaten mit mehrfach gefärbten Zellen. Dies wurde verwirklicht mit Hilfe eines kommerziellen motorisierten Mikroskops, objekt-orientierter Programmierung und durch Entwicklung eines spezifischen Arbeitsflusses. Schliesslich kam das System in diversen Forschungsprojekten zum Einsatz, insbesondere bei Untersuchungen zur Bakterioplankton-Dynamik während Frühjahresblüten des Phytoplanktons im Zürichsee. Bei der Systementwicklung wurde besonderer Wert auf die Lösung grundlegender technischer Probleme im Zusammenhang mit der automatisierten Hochdurchsatzmikroskopie für die aquatische Mikrobiologie gelegt. Zum einen wurde ein neues schnelles und zuverlässiges Autofokus-System entwickelt. Dieses erlaubt es, die Qualität eines Bildfeldes vor der Bildaufnahme zu beurteilen, indem an mehreren Stellen fokussiert und damit die lokale Topologie eines Präparates erfasst wird. Zum anderen ist es notwendig, automatisch aufgenommene Bilder auf deren Qualität hin zu überprüfem, um die Präzision der nachfolgenden Zellzählung mittels Bildanalyse zu gewährleisten. Dazu wurde ein vollautomatisches System entwickelt welches auf einem künstlichen neuronalen Netzwerk basiert. Neben diesen rein technischen wurden auch biologische Fragestellungen bearbeitet. Einerseits wurde ein neues, konturbasiertes, bildanalytisches Verfahren entwickelt um das Biovolumen von Bakterien, eine ökologisch bedeutende Kenngrösse, die mittels Mikroskopie ermittelt werden kann, unabhängig von der bakteriellen Morphologie, genau zu bestimmen. Zum anderen wurde eine neue, model-basierte objekt-orientierte Bildanalysemethode entwickelt, um häufige filamentöse Cyanobakterien, beispielsweise Planktothrix rubescens, in der Wassersäule von Seen vollautomatisch zu quantifizieren.
Zeder, Michael