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DNA repair mechanism in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans and in human


Buob, Rebecca. DNA repair mechanism in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans and in human. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

1. Summary 1.1. English

Cells encounter a plethora of DNA insults every day. To counteract these detrimental effects on the genome, they have evolved sophisticated mechanisms; on the one hand the cells detect the damage by specific DNA damage sensor proteins, which activate checkpoint proteins to either halt the cell cycle to allow repair, or, in cases of too massive DNA damage, guide the cell into controlled cell death, called apoptosis. Various DNA repair pathways on the other hand attempt to repair the damage, in the best case restoring the unaltered DNA, therefore preventing genome instability. The aim of this thesis was to investigate different DNA repair mechanisms in two different organisms, first in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) and second in human cells. In the first part, two putative DNA ligases of D. radiodurans were investigated, leading to the biochemical characterization of the NAD+-dependent DNA ligase of D. radiodurans. The DNA ligase activity was most efficient in the presence of 1mM MnCl2 whereas the substitution of MnCl2 by MgCl2 or CaCl2 reduced the activity about ten fold. A second, putative ATP-dependent DNA ligase showed no apparent ligase activity, although an adenylyltransferase intermediate could be identified. Furthermore, the characterization of the putative O6- methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) of D. radiodurans was performed. Although cloning and purification were successful, the enzymatic characterization was not possible because no methyltransferase activity was observed, although folding of the protein was correct as it bound to DNA. In the second part, the in our laboratory discovered interaction of the human Rad9/Rad1/Hus1-complex (9-1-1 complex) with the apurinic/apyriminidinic endonuclease 1 (Ape1) was further characterized. With the use of protein fragments it was found that the endonuclease activity of Ape1 is located in its N-terminus. Furthermore the results indicated that the interaction of the 9-1-1 complex with Ape1 involves the entire Ape1 protein. In addition, observation was made indicating a previously unknown interaction of the 9-1-1 complex with human DNA polymerase .



3 1.2. German

Zellen erfahren jeden Tag viele DNA Schäden. Um diesen nachteiligen Effekten auf das Genom entgegenzuwirken, haben die Zellen hochstehende Mechanismen entwickelt; auf der einen Seite detektieren sie die Schäden durch spezifische DNA Schadenssensor-Proteine, welche ihrerseits Checkpoint-Proteine aktivieren, die entweder den Zellzyklus anhalten, um die DNA Reparatur zu ermöglichen, oder, falls die Schäden zu massiv sind, die Zelle in den kontrollierten Zelltod, die Apopotose, führen. Die verschiedenen DNA Reparaturmechansimen auf der anderen Seite, versuchen den Schaden zu reparieren und im besten Fall die unveränderte DNA wieder herzustellen und dadurch genomische Instabilität zu verhindern. Das Ziel dieser Studie war es, verschiedene DNA Reparaturmechanismen in zwei verschiedenen Organismen, nämlich in Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) und in menschlichen Zellen, zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden zwei vermeintliche DNA Ligasen von D. radiodurans bearbeitet, was zur biochemischen Charakterisierung einer NAD+-abhängigen DNA Ligase geführt hat. Es konnte gezeigt werden, dass die DNA Ligaseaktivität in der Gegenwart von 1mM MnCl2 am effizientisten war, wobei die Substitution von MnCl2 durch MgCl2 oder CaCl2 die Ligaseaktivität etwa um das zehnfache reduziert hat. Bei der zweiten, vermeintlich ATP-abhängigen DNA Ligase konnte keine Ligaseaktivität festgestellt werden, obwohl ein Adenylyltransferase Intermediat gebildet wurde. Im weiteren wurde die O6-methylguanin-DNA methyltransferase (MGMT) von D. radiodurans untersucht. Obwohl die Klonierung und die Reinigung erfolgreich waren, war die biochemische Charakterisierung nur bedingt möglich, da keine Methyltransferaseaktivität festgestellt werden konnte. Die Faltung des Proteins schien korrekt, da die MGMT an DNA binden konnte. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde die in unserem Labor beschriebene Interaktion zwischen dem Rad9/Rad1/Hus1-Komplex (9-1-1 Komplex) mit der apurinischen/apyrimidinischen Endonuklease 1 (Ape1) weiter untersucht. Durch den Gebrauch von Protein-Fragmenten konnte gezeigt werden, dass sich die Endonuklease Aktivität im N-terminalen Teil des Proteins befindet.



4 Weiter deuten die Erkenntnisse darauf hin, dass in der Interaktion zwischen dem 9-1-1 Komplex und Ape1 das komplette Ape1-Protein involviert ist. Schliesslich zeigen initiale Beobachtungen, dass der 9-1-1 Komplex auch mit der DNA-Polymerase interagiert, was bis dato nicht bekannt war.



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Abstract

1. Summary 1.1. English

Cells encounter a plethora of DNA insults every day. To counteract these detrimental effects on the genome, they have evolved sophisticated mechanisms; on the one hand the cells detect the damage by specific DNA damage sensor proteins, which activate checkpoint proteins to either halt the cell cycle to allow repair, or, in cases of too massive DNA damage, guide the cell into controlled cell death, called apoptosis. Various DNA repair pathways on the other hand attempt to repair the damage, in the best case restoring the unaltered DNA, therefore preventing genome instability. The aim of this thesis was to investigate different DNA repair mechanisms in two different organisms, first in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) and second in human cells. In the first part, two putative DNA ligases of D. radiodurans were investigated, leading to the biochemical characterization of the NAD+-dependent DNA ligase of D. radiodurans. The DNA ligase activity was most efficient in the presence of 1mM MnCl2 whereas the substitution of MnCl2 by MgCl2 or CaCl2 reduced the activity about ten fold. A second, putative ATP-dependent DNA ligase showed no apparent ligase activity, although an adenylyltransferase intermediate could be identified. Furthermore, the characterization of the putative O6- methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) of D. radiodurans was performed. Although cloning and purification were successful, the enzymatic characterization was not possible because no methyltransferase activity was observed, although folding of the protein was correct as it bound to DNA. In the second part, the in our laboratory discovered interaction of the human Rad9/Rad1/Hus1-complex (9-1-1 complex) with the apurinic/apyriminidinic endonuclease 1 (Ape1) was further characterized. With the use of protein fragments it was found that the endonuclease activity of Ape1 is located in its N-terminus. Furthermore the results indicated that the interaction of the 9-1-1 complex with Ape1 involves the entire Ape1 protein. In addition, observation was made indicating a previously unknown interaction of the 9-1-1 complex with human DNA polymerase .



3 1.2. German

Zellen erfahren jeden Tag viele DNA Schäden. Um diesen nachteiligen Effekten auf das Genom entgegenzuwirken, haben die Zellen hochstehende Mechanismen entwickelt; auf der einen Seite detektieren sie die Schäden durch spezifische DNA Schadenssensor-Proteine, welche ihrerseits Checkpoint-Proteine aktivieren, die entweder den Zellzyklus anhalten, um die DNA Reparatur zu ermöglichen, oder, falls die Schäden zu massiv sind, die Zelle in den kontrollierten Zelltod, die Apopotose, führen. Die verschiedenen DNA Reparaturmechansimen auf der anderen Seite, versuchen den Schaden zu reparieren und im besten Fall die unveränderte DNA wieder herzustellen und dadurch genomische Instabilität zu verhindern. Das Ziel dieser Studie war es, verschiedene DNA Reparaturmechanismen in zwei verschiedenen Organismen, nämlich in Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) und in menschlichen Zellen, zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden zwei vermeintliche DNA Ligasen von D. radiodurans bearbeitet, was zur biochemischen Charakterisierung einer NAD+-abhängigen DNA Ligase geführt hat. Es konnte gezeigt werden, dass die DNA Ligaseaktivität in der Gegenwart von 1mM MnCl2 am effizientisten war, wobei die Substitution von MnCl2 durch MgCl2 oder CaCl2 die Ligaseaktivität etwa um das zehnfache reduziert hat. Bei der zweiten, vermeintlich ATP-abhängigen DNA Ligase konnte keine Ligaseaktivität festgestellt werden, obwohl ein Adenylyltransferase Intermediat gebildet wurde. Im weiteren wurde die O6-methylguanin-DNA methyltransferase (MGMT) von D. radiodurans untersucht. Obwohl die Klonierung und die Reinigung erfolgreich waren, war die biochemische Charakterisierung nur bedingt möglich, da keine Methyltransferaseaktivität festgestellt werden konnte. Die Faltung des Proteins schien korrekt, da die MGMT an DNA binden konnte. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde die in unserem Labor beschriebene Interaktion zwischen dem Rad9/Rad1/Hus1-Komplex (9-1-1 Komplex) mit der apurinischen/apyrimidinischen Endonuklease 1 (Ape1) weiter untersucht. Durch den Gebrauch von Protein-Fragmenten konnte gezeigt werden, dass sich die Endonuklease Aktivität im N-terminalen Teil des Proteins befindet.



4 Weiter deuten die Erkenntnisse darauf hin, dass in der Interaktion zwischen dem 9-1-1 Komplex und Ape1 das komplette Ape1-Protein involviert ist. Schliesslich zeigen initiale Beobachtungen, dass der 9-1-1 Komplex auch mit der DNA-Polymerase interagiert, was bis dato nicht bekannt war.



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:26 Feb 2010 14:55
Last Modified:24 Sep 2019 16:47
Number of Pages:107
Additional Information:Enthält Sonderdruck
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod006058880&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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