Abstract
It is crucial for every cell of an organism to sense and repair defects that occur in its genetic material. Cells are constantly exposed to DNA-damaging agents from exogenous and endogenous sources such as the Sun’s radiation or metabolically produced free oxygen radicals. The mechanisms to deal with DNA damage consist of repair systems as well as kinase-dependent signaling pathways (so-called DNA damage checkpoints) that delay or arrest cell cycle progression. The response to DNA damage also includes alteration of transcription and regulation of apoptosis. This complex signaling network is referred to as the DNA damage response (DDR). Of all types of DNA damage, DNA double strand breaks (DSBs) pose the greatest challenge to cells. If DSBs remain un-repaired or are repaired incorrectly, the genome can suffer translocations and deletions, which may ultimately lead to genome instability and harmful diseases such as cancer. In response to DSBs, the MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) complex acts as sensor and activates the proximal kinases ATM and DNA-PKcs. These kinases phosphorylate various target proteins including the histone variant H2AX. MDC1 is an essential mediator/adaptor protein that directly binds to phosphorylated H2AX ( H2AX) through its tandem BRCT domains. In addition, MDC1 is necessary for the amplification of the signal and for establishing a chromatin environment that is proficient for efficient repair of DSBs. In this study, we describe the molecular mechanism of MDC1-mediated accumulation and retention of the MRN complex in chromatin regions flanking DSBs. MDC1 is constitutively phosphorylated at multiple conserved SDT motifs by Casein kinase 2 (CK2). The MRN accumulation is achieved through direct binding of the FHA and BRCT tandem domain of NBS1 to the phosphorylated SDT motifs of MDC1. Mutations in conserved amino acids within the NBS1 FHA and BRCT domains, which are essential for the binding to the phospho-epitope, revealed that the accumulation of MRN in IRIF is not required for the activation of the G2/M checkpoint response. Interestingly, while cells containing a mutation in the BRCT domain of NBS1 had only a minor G2/M checkpoint defect, cells harboring a NBS1 mutated in its FHA domain showed a clear G2/M checkpoint defect at low doses of irradiation. These results suggest an additional function of the FHA domain of NBS1 in checkpoint signaling. During the search for ATM-dependent phosphorylation sites in MDC1 we identified the Thr4 residue to be targeted in a DNA damage specific manner. Interestingly, this residue bound to the FHA domain of MDC1 itself leading to dimerization of the protein. This interaction was confirmed by isothermal titration calorimetry (ITC) and X-ray crystallography, revealing that the FHA domains of two MDC1 molecules associate in a head-to-tail orientation in a DNA damage-dependent manner. These findings add MDC1 to the growing list of mediator/adaptor proteins that show dimerization and/or oligomerization. In summary, this work thus contributes substantially to our understanding of the mechanisms by which the mediator/adaptor protein MDC1 functions in the mammalian DDR.
Es ist von entscheidender Bedeutung für jede Zelle eines Organismus, Defekte im Genom zu erkennen und zu reparieren. Zellen sind andauernd Substanzen ausgesetzt, welche die DNS beschädigen. Diese können von der Umwelt (z.B. Sonnenstrahlung) oder durch den Organismus selbst (z.B. freie Sauerstoffradikale) produziert werden. Die Mechanismen, um auf solche DNS Schäden zu reagieren, bestehen aus Reparatur-systemen sowie Kinase abhängigen Signalwegen (sogenannte Kontrollpunkte), welche den Zellzyklus verzögern oder anhalten. Die zelluläre Antwort auf Schäden in der DNS beinhaltet ausserdem die Regulierung der Transkription und des programmierten Zelltodes (Apoptose). Von allen Arten von Schäden der DNS stellt der Doppelstrangbruch die grösste Gefahr für eine Zelle dar. Wenn Doppelstrangbrüche nicht erkannt oder falsch repariert werden, kann das Genom durch Translokationen und Deletionen verändert werden. Diese Veränderungen können zu Instabilität des Genoms und zu gefährlichen Krankheiten (z.B. Krebs) führen. Der MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) Komplex dient als Sensor für die Erkennung von Doppelstrangbrüchen. Er aktiviert die Kinasen ATM und DNA-PKcs, welche verschiedene Proteine phosphorylieren, darunter auch die Histon Variante H2AX. MDC1 ist ein essenzielles Adapterprotein, welches via seine BRCT Domänen direkt an phosphoryliertes H2AX bindet. Im Weiteren ermöglicht MDC1 die Rekrutierung von verschiedenen Proteinen, welche für die Reparatur und die Signalübertragung wichtig sind. Dadurch hilft MDC1 bei der Bildung einer Chromatinumgebung, welche die effiziente Reparatur von Doppelstrangbrüchen ermöglicht. In dieser Arbeit beschreiben wir den molekularen Mechanismus, wie MDC1 den MRN Komplex bindet und zu Doppelstrangbrüchen rekrutiert. MDC1 wird in mehreren SDT Motifen durch die Casein Kinase 2 konstitutiv phosphoryliert. Die Akkumulierung von MRN erfolgt durch die direkte Bindung der FHA und BRCT Domänen von NBS1 an die phosphorylierten SDT Motife von MDC1. Mutationen in konservierten Aminosäuren innerhalb der FHA und BRCT Domänen von NBS1 zeigten, dass die Bindung von MRN nicht für die Aktivierung des G2/M Kontrollpunktes verantwortlich ist. Interessanterweise hatten nur die Zellen mit einer Mutation in der FHA Domäne von NBS1 einen Defekt im G2/M Kontrollpunkt, nicht aber die Zellen mit einer Mutation in der BRCT Domäne von NBS1. Diese Resultate deuten auf eine zusätzliche Funktion der FHA Domäne von NBS1 im Signalweg nach DNS Schäden hin.
Die Suche nach ATM abhängigen Phosphorylierungs-Stellen in MDC1 zeigte, dass die Aminosäure Thr4 als Folge von DNS-Schäden phosphoryliert wird. Diese Aminosäure bindet an die FHA Domäne von MDC1, was zu einer Dimerisierung des Proteins führt. Diese Bindung konnte mit Hilfe von Isothermaler Titrations Kalorimetrie sowie Röntgenstrahl-Kristallographie bestätigt werden. Dabei stellten wir fest, dass die FHA Domänen von zwei MDC1 Molekülen in umgekehrter Orientierung aneinander binden. Diese Resultate fügen MDC1 zur wachsenden Liste von Adapterproteinen hinzu, welche Dimere oder Oligomere bilden können. Insgesamt trägt diese Arbeit substanziell zu unserem Verständnis der Mechanismen bei, wie das Adapterprotein MDC1 in der zellulären Antwort auf Schäden in der DNS wirkt.
Spycher, Christoph