Abstract
To allow the correct functioning of an organism and to adapt to physiological and environmental changes, the expression of a specific subset of genes in each different cell type has to be tightly regulated. Nuclear factor κB (NF-κB-) is a family of inducible transcription factors able to drive the transcription of hundreds of genes implicated in the regulation of several cellular processes such as innate and acquired immunity, cell proliferation and apoptosis. The aim of this thesis was to investigate how acetylation of p65, the best-studied subunit of NF-κB-, affects NF-κB-driven transcription. Our results indicate that p65 is acetylated by p300 in vitro and in vivo at lysines 310, 314 and 315. Acetylation of p65 does not influence nuclear-cytoplasmic shuttling, DNA binding or cell viability in response to TNFα. Genome-wide gene expression analysis revealed that p65 acetylation seems to play a role in NF-κB-dependent gene expression. Real-time RT-PCR analysis of specific genes suggest that acetylation at lysine 310 is required for full activation of a subset of genes, while acetylation at lysines 314 and 315 is needed for the decreased expression of another group of genes. We also identified SIRT2 as a novel p65 deacetylase. SIRT2 belongs to the family of NAD+-dependent deacetylases called sirtuins. Deacetylation assays performed in vitro or in HEK 293T cells with overexpressed proteins revealed that SIRT2 deacetylates p65 at all three lysines 310, 314 and 315. Furthermore, p65 is hyperacetylated at lysine 310 in Sirt2-/- MEFs after TNFα stimulation in vivo. Both endogenous proteins interact in the cytoplasm of Jurkat T-cells under basal conditions. While p65 shuttles to the nucleus in response to TNFα stimulation, SIRT2 stays in the cytoplasm, implying that SIRT2 deacetylates p65 in the cytoplasm. Furthermore, gene expression of Mpa2l, a gene found to require acetylation of p65 at K310 for its proper expression, was misregulated in Sirt2-/- MEFs. In addition, we studied the role of CARM1 as a transcriptional coactivator of NF-κB-. A subset of NF-κB--dependent genes that require CARM1, but not its enzymatic activity, for their proper expression was identified. Together, our data suggests that p65 acetylation regulates the expression of specific NF-κB-dependent genes and that this is in part controlled by SIRT2-mediated p65 deacetylation.
ZUSAMMENFASSUNG
Damit ein Organismus korrekt funktioniert und sich an Umwelteinflüsse und intrazelluläre Veränderungen anpassen kann, muss die Expression spezifischer Gene in jedem Zelltyp fest reguliert sein. Nukleärer Faktor κB-(NF-κB-) ist eine Familie von induzierbaren Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von Hunderten von Genen steuern kann, die in verschiedenen zellulären Prozessen wie der angeborenen und erworbenen Immunität, der Zellvermehrung sowie der Apoptose, beteiligt sind. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es zu untersuchen, wie die Acetylierung von p65, einer der wichtigsten Untereinheiten von NF-κB-, die Funktion von NF-κB- beeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass p65 von p300 in vitro und in vivo an drei Lysinen 310, 314 und 315 acetyliert wird. Die Acetylierung von p65 hatte keinen Einfluss auf die Translokation von p65 in den Nukleus, auf die DNA Bindung oder auf das Überleben der Zellen nach Stimulierung mit TNFα. Eine genom-weite Genexpressionsanalyse deutete darauf hin, dass die Acetylierung von p65 eine wichtige Rolle in der Modulierung der NF-κB-abhängigen Genexpression spielt. Real-time RT-PCR Analysen von verschiedenen Genen zeigen, dass die Acetylierung von Lysin 310 für die vollständige Expression einiger Gene erforderlich ist, während die Acetylierung von Lysin 314 und 315 für die reduzierte Expression anderer Gene benötigt wird. Zusätzlich haben wir SIRT2 als neue p65 Deacetylase identifiziert. SIRT2 gehört zu den Sirtuinen, einer Familie von NAD+-abhängigen Deacetylasen. Deacetylierungs- experimente in vitro oder in Zellen mit überexprimierten Proteinen zeigten, dass SIRT2 p65 an allen drei Lysinen 310, 314 und 315 deacetyliert. Ausserdem war p65 an Lysine 310 in Sirt2-/- MEFs nach Stimulierung mit TNFα hyperacetyliert. Endogenes p65 und SIRT2 interagierten im Zytoplasma von unstimulierten Jurkat T-Zellen. Während sich p65 nach Stimulierung mit TNFα in den Nukleus translozierte, blieb SIRT2 im Zytoplasma. Dies deutet darauf hin, dass SIRT2 p65 im Zytoplasma deacetyliert. Die Genexpression von Mpa2l, für dessen richtige Expression die Acetylierung von p65 an K310 benötigt wird, war in Sirt2-/- MEFs dereguliert. Zusammengefasst sprechen unsere Ergebnisse dafür, dass die Acetylierung von p65 die Expression von bestimmten NF-κB-abhängigen Genen reguliert und dass dies zum Teil durch SIRT2-vermittelte Deacetylierung von p65 kontrolliert wird.
Rothgiesser, Karin M