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Inborn errors of metabolism with a focus on functional analysis of a special mutation in MCCB causing 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency, and MMADHC in intracellular vitamin B₁₂ metabolism, a gene in which mutations can lead to three different phenotypes


Stucki, Martin. Inborn errors of metabolism with a focus on functional analysis of a special mutation in MCCB causing 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency, and MMADHC in intracellular vitamin B₁₂ metabolism, a gene in which mutations can lead to three different phenotypes. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

SUMMARY The present work focuses on two autosomal recessive inborn errors of metabolism, 3- methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCC) deficiency, a defect in the catabolism of leucine, and on the cblD defect of intracellular vitamin B12 (cobalamin) metabolism. MCC is a heteromeric mitochondrial enzyme composed of biotin-containing α (MCCA) and smaller β (MCCB) subunits encoded by MCCA and MCCB, respectively. We report studies of the c.1054G→A mutation in exon 11 of MCCB detected in the homozygous state in a patient with MCC deficiency. Sequence analysis of MCCB cDNA revealed two overlapping transcripts, one containing the normal 73 bp of exon 11 including the missense mutation c.1054G→A (p.G352R), the other with exon 11 replaced by a 64 bp sequence from intron 10 (cryptic exon) that maintains the reading frame and is flanked by acceptable splice consensus sites. In expression studies, we show that both transcripts lack detectable MCC activity. Western blot analysis showed slightly reduced levels of MCCB using the transcript containing the missense mutation, whereas no MCCB was detected with the transcript containing the cryptic exon. Analysis of the region harboring the mutation revealed that the c.1054G→A mutation is located in an exon splice enhancer sequence. Using MCCB minigene constructs to transfect MCCB-deficient fibroblasts, we demonstrate that the reduction in utilization of exon 11 associated with the c.1054G→A mutation is due to alteration of this exon splice enhancer. Further, we show that optimization of the weak splice donor site of exon 11 corrects the splicing defect. To our knowledge, this is the first demonstration of a point mutation disrupting an exon splice enhancer that causes exon skipping along with utilization of a cryptic exon. In man, cobalamin is an essential cofactor in only two metabolic pathways. Intracellular conversion of cobalamin to its two coenzymes, adenosylcobalamin (AdoCbl) in mitochondria and methylcobalamin (MeCbl) in the cytoplasm, is necessary for the homeostasis of methylmalonic acid and homocysteine. We have identified the MMADHC gene responsible for the cblD defect that can cause isolated methylmalonic aciduria, isolated homocystinuria, or both. Various mutations are associated with each of the three biochemical phenotypes of the disorder. Using expression vectors containing the wildtype MMADHC with an enhanced mitochondrial leader sequence, mutations changing possible downstream sites of reinitiation or mutations introducing stop codons, we provide evidence that reinitiation of translation at downstream AUGs explains most of the phenotypes found in cblD patients. Furthermore, our data indicate that the sequence after Met116 is sufficient for MeCbl synthesis whereas the sequence between Met62 and Met116 is required for AdoCbl synthesis. Our findings support the hypothesis that a delicate balance exists between cytosolic MeCbl and mitochondrial AdoCbl synthesis, supporting the role of the MMADHC protein as a branching point in intracellular cobalamin trafficking. ZUSAMMENFASSUNG Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei autosomal rezessiv vererbten Stoffwechselkrankheiten, dem 3-Methylcrotonyl-CoA Carboxylase (MCC) Mangel, welches ein Defekt im Leuzin-Abbau ist, und dem cblD Defekt, einer Störung des intrazellulären Vitamin B12 (Cobalamin) Stoffwechsels. MCC ist ein heteromeres mitochondriales Enzym aus Biotin-bindenden α (MCCA) und kleineren β (MCCB) Untereinheiten, welche durch MCCA und MCCB kodiert sind. Wir berichten über die Mutation c.1054G>A (p.G352R) in Exon 11 von MCCB, welche wir homozygot bei einem MCC-Patienten gefunden haben. Die Analyse der cDNA Sequenz von MCCB ergab zwei überlappende Transkripte: eines mit der Mutation c.1054G>A, sowie ein weiteres mit Ersatz der 73 bp von Exon 11 durch 64 bp aus Intron 10. Dieses kryptische Exon verändert das Leseraster nicht und weist akzeptable Spleiss-Stellen auf. Expressionsstudien zeigen, dass beide Transkripte keine MCC Aktivität besitzen bei nur reduzierter Proteinmenge beim mutationstragenden Transkript sowie Proteinverlust des Transkriptes mit kryptischem Exon. Die Mutation c.1054G>A ist Teil eines Exon-Spleiss- Enhancers. Transfektionsexperimente von MCCB Minigen Konstrukten in MCCB defizienten Fibroblasten zeigten bei Veränderung des Exon-Spleiss-Enhancers ein vermindertes Spleissen von Exon 11. Zudem konnte bei Sequenz-Optimierung der Exon 11-Spleiss- Stellen der Spleiss-Defekt korrigiert werden. Unseres Wissens ist dies der erste Nachweis eines durch Punktmutation in einem Exon-Spleiss-Enhancer resultierenden Exonverlustes bei gleichzeitiger Insertion eines kryptischen Exons. Beim Menschen wird Cobalamin für nur zwei Reaktionsschritte des Stoffwechsels benötigt: als mitochondriales Adenosylcobalamin (AdoCbl) für den Abbau von Methylmalonsäure und als zytosolisches Methylcobalamin (MeCbl) für die Methylierung von Homocystein. Bei Vorliegen eines cblD-Defektes besteht eine Methylmalonazidurie, eine Hyperhomocysteinämie oder eine Kombination aus beiden Symptomen. Uns gelang die Klonierung des MMADHC Gens, welches für den cblD Defekt verantwortlich ist. Verschiedene Mutationen sind mit den drei Phänotypen des cblD-Defektes assoziiert. Durch Veränderung der mitochondrialen Importsequenz, durch Korrektur der zusätzlichen AUGs (Transkriptions-Start) und durch Einfügen weiterer Stop-Mutationen konnte gezeigt werden, dass eine Reinitiation der Transkription an weiteren AUGs die in cblD Patienten gefundenen Phänotypen erklären könnte. Weiter haben wir Hinweise darauf, dass ein cblD-Protein mit Beginn bei Met116 weiter MeCbl synthetisieren kann, und dass die Sequenz zwischen Met62 und Met116 notwendig für die Synthese von AdoCbl ist. Unsere Resultate bestätigen die Hypothese eines kritischen Gleichgewichts zwischen zytosolischer MeCbl und mitochondrialer AdoCbl Synthese. Das MMADHC Protein spielt somit eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Cobalamin Verteilung.

Abstract

SUMMARY The present work focuses on two autosomal recessive inborn errors of metabolism, 3- methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCC) deficiency, a defect in the catabolism of leucine, and on the cblD defect of intracellular vitamin B12 (cobalamin) metabolism. MCC is a heteromeric mitochondrial enzyme composed of biotin-containing α (MCCA) and smaller β (MCCB) subunits encoded by MCCA and MCCB, respectively. We report studies of the c.1054G→A mutation in exon 11 of MCCB detected in the homozygous state in a patient with MCC deficiency. Sequence analysis of MCCB cDNA revealed two overlapping transcripts, one containing the normal 73 bp of exon 11 including the missense mutation c.1054G→A (p.G352R), the other with exon 11 replaced by a 64 bp sequence from intron 10 (cryptic exon) that maintains the reading frame and is flanked by acceptable splice consensus sites. In expression studies, we show that both transcripts lack detectable MCC activity. Western blot analysis showed slightly reduced levels of MCCB using the transcript containing the missense mutation, whereas no MCCB was detected with the transcript containing the cryptic exon. Analysis of the region harboring the mutation revealed that the c.1054G→A mutation is located in an exon splice enhancer sequence. Using MCCB minigene constructs to transfect MCCB-deficient fibroblasts, we demonstrate that the reduction in utilization of exon 11 associated with the c.1054G→A mutation is due to alteration of this exon splice enhancer. Further, we show that optimization of the weak splice donor site of exon 11 corrects the splicing defect. To our knowledge, this is the first demonstration of a point mutation disrupting an exon splice enhancer that causes exon skipping along with utilization of a cryptic exon. In man, cobalamin is an essential cofactor in only two metabolic pathways. Intracellular conversion of cobalamin to its two coenzymes, adenosylcobalamin (AdoCbl) in mitochondria and methylcobalamin (MeCbl) in the cytoplasm, is necessary for the homeostasis of methylmalonic acid and homocysteine. We have identified the MMADHC gene responsible for the cblD defect that can cause isolated methylmalonic aciduria, isolated homocystinuria, or both. Various mutations are associated with each of the three biochemical phenotypes of the disorder. Using expression vectors containing the wildtype MMADHC with an enhanced mitochondrial leader sequence, mutations changing possible downstream sites of reinitiation or mutations introducing stop codons, we provide evidence that reinitiation of translation at downstream AUGs explains most of the phenotypes found in cblD patients. Furthermore, our data indicate that the sequence after Met116 is sufficient for MeCbl synthesis whereas the sequence between Met62 and Met116 is required for AdoCbl synthesis. Our findings support the hypothesis that a delicate balance exists between cytosolic MeCbl and mitochondrial AdoCbl synthesis, supporting the role of the MMADHC protein as a branching point in intracellular cobalamin trafficking. ZUSAMMENFASSUNG Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei autosomal rezessiv vererbten Stoffwechselkrankheiten, dem 3-Methylcrotonyl-CoA Carboxylase (MCC) Mangel, welches ein Defekt im Leuzin-Abbau ist, und dem cblD Defekt, einer Störung des intrazellulären Vitamin B12 (Cobalamin) Stoffwechsels. MCC ist ein heteromeres mitochondriales Enzym aus Biotin-bindenden α (MCCA) und kleineren β (MCCB) Untereinheiten, welche durch MCCA und MCCB kodiert sind. Wir berichten über die Mutation c.1054G>A (p.G352R) in Exon 11 von MCCB, welche wir homozygot bei einem MCC-Patienten gefunden haben. Die Analyse der cDNA Sequenz von MCCB ergab zwei überlappende Transkripte: eines mit der Mutation c.1054G>A, sowie ein weiteres mit Ersatz der 73 bp von Exon 11 durch 64 bp aus Intron 10. Dieses kryptische Exon verändert das Leseraster nicht und weist akzeptable Spleiss-Stellen auf. Expressionsstudien zeigen, dass beide Transkripte keine MCC Aktivität besitzen bei nur reduzierter Proteinmenge beim mutationstragenden Transkript sowie Proteinverlust des Transkriptes mit kryptischem Exon. Die Mutation c.1054G>A ist Teil eines Exon-Spleiss- Enhancers. Transfektionsexperimente von MCCB Minigen Konstrukten in MCCB defizienten Fibroblasten zeigten bei Veränderung des Exon-Spleiss-Enhancers ein vermindertes Spleissen von Exon 11. Zudem konnte bei Sequenz-Optimierung der Exon 11-Spleiss- Stellen der Spleiss-Defekt korrigiert werden. Unseres Wissens ist dies der erste Nachweis eines durch Punktmutation in einem Exon-Spleiss-Enhancer resultierenden Exonverlustes bei gleichzeitiger Insertion eines kryptischen Exons. Beim Menschen wird Cobalamin für nur zwei Reaktionsschritte des Stoffwechsels benötigt: als mitochondriales Adenosylcobalamin (AdoCbl) für den Abbau von Methylmalonsäure und als zytosolisches Methylcobalamin (MeCbl) für die Methylierung von Homocystein. Bei Vorliegen eines cblD-Defektes besteht eine Methylmalonazidurie, eine Hyperhomocysteinämie oder eine Kombination aus beiden Symptomen. Uns gelang die Klonierung des MMADHC Gens, welches für den cblD Defekt verantwortlich ist. Verschiedene Mutationen sind mit den drei Phänotypen des cblD-Defektes assoziiert. Durch Veränderung der mitochondrialen Importsequenz, durch Korrektur der zusätzlichen AUGs (Transkriptions-Start) und durch Einfügen weiterer Stop-Mutationen konnte gezeigt werden, dass eine Reinitiation der Transkription an weiteren AUGs die in cblD Patienten gefundenen Phänotypen erklären könnte. Weiter haben wir Hinweise darauf, dass ein cblD-Protein mit Beginn bei Met116 weiter MeCbl synthetisieren kann, und dass die Sequenz zwischen Met62 und Met116 notwendig für die Synthese von AdoCbl ist. Unsere Resultate bestätigen die Hypothese eines kritischen Gleichgewichts zwischen zytosolischer MeCbl und mitochondrialer AdoCbl Synthese. Das MMADHC Protein spielt somit eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Cobalamin Verteilung.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Verrey François, Baumgartner M R
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:16 Jul 2010 08:38
Last Modified:08 Feb 2019 14:54
Number of Pages:108
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod006160359&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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