Abstract
P-glycoprotein (P-gp) is an exceptional membrane transporter because of its ability to carry a large variety of compounds across the plasma membrane. Thanks to this substrate promiscuity, P-gp over-expression is responsible for multidrug resistance (MDR) in a variety of cells from microorganisms to humans. The cellular MDR is responsible for failure of treatment in over 90% of patients with metastatic cancer, as well as in yeast and bacteria infections and in life-threatening human parasites such as Plasmodium causing malaria. P-gp is not only expressed in multidrug resistant cells but also in non-resistant cells at basal levels, but its physiological functions in the absence of drug pressure are not well understood. So far P-gp was proposed to be involved in several important cellular processes ranging from immunological functions to membrane lipid remodelling. Given the importance of P-gp in human and microbial MDR, there was an important need to identify the substrates and transport activities of this protein and to understand its physiological functions as a basis for the rational design of new drugs and MDR inhibitors. P-gp is localized mainly in the plasma membrane. Because the plasma membrane is the first barrier that intracellular pathogens need to cross to infect the host cell, we wanted to investigate whether P-gp plays a role in this first line host-pathogen interaction. As a model pathogen we used the human parasite Toxoplasma gondii, which causes toxoplasmosis, a potentially life-threatening disease in individuals with immunodeficiency. As both host cell and parasite have a P-gp localized in the plasma membrane, we hypothesised that both P-gps could be involved in events during parasite infection and replication. Our project had two goals: i) to characterize the physiological functions of host cell P-gp and its contribution to host-parasite interactions and ii) to characterize the T. gondii P-gp and its function in host-parasite interactions. To investigate the physiological functions of host cell P-gp and its contribution to host-parasite interactions, we compared three mouse embryonic fibroblast cell lines with different P-gp expression: wild type cells (WT) and P-gp knockout (P-gp KO) cells, as well as P-gp complemented P-gp KO (P-gp KO/P-gp) cells. We used these cell lines to analyse the role of host P-gp in parasite invasion, replication and cholesterol transport, processes that are crucial for successful T. gondii propagation and survival. We showed that host P- gp is essential for normal T. gondii replication and specifically required for cholesterol transport from host endo- lysosomes to the parasite. Importantly, using cholesterol auxotrophic T. gondii replication as a bio- indicator of cholesterol homeostasis in the host cell, we found that P-gp is involved in host cholesterol trafficking from endo-lysosomes to the plasma membrane. To characterize the T. gondii P-gp and its function in host-parasite interactions, we pharmacologically inhibited parasite P-gp (TgP-gp) with the P-gp specific inhibitor GF120918 (GF) and we used P- gp KO host cells to avoid the contribution of host P-gp to the observed phenotype. We analysed the role of parasite P-gp in invasion, replication and lipid metabolism. We showed that T. gondii P-gp is crucial for parasite Ca2+-depended attachment and invasion. Moreover, we propose that TgP- gp is involved in Ca2+ signalling which is important for the regulation of these processes and essential for T. gondii survival. Importantly, TgP-gp functionality is required for successful T. gondii replication and involved in the parasite lipid synthesis and transport. In summary, in this study we showed for the first time that both host cell and parasite P-gp have an important role in host-parasite interactions. I was also involved in a joint project focusing on the epigenetic regulation of stage conversion of Giardia lamblia. G. lamblia is an intestinal pathogen which infects millions of people all over the world causing the disease giardiasis. G. lamblia resides in the upper small intestine of humans and other vertebrates which become infected by ingestion of cysts from contaminated water or food. Giardia is characterized by two different developmental stages: the motile, proliferating trophozoites responsible for the clinical manifestation of the disease such as diarrhoea and malabsorption, and the cyst forms, the infective stage of the parasite. Infectious cysts are environmentally resistant and protected by a rigid extracellular matrix, the cyst wall. Stage conversion of G. lamblia is essential for transmission and survival of this human pathogen, but the understanding of the molecular mechanism which regulates this fundamental process still remains poorly understood. In this project we aimed to analyse the effect of histone deacetylase inhibitor FR235222 on gene regulation of stage conversion in G. lamblia. We showed for the first time that inhibition of a histone deacetylase activity in Giardia with FR235222 induced transcriptional changes in proliferating and differentiating stages and potently blocked formation of cysts. We propose that G. lamblia stage conversion is under the control of epigenetic regulation and dependent on the acetylation state of histones. In addition, histone deacetylase activity could be a promising target for developing new anti-Giardia drugs since the inhibition of histone deacetylase activity is blocking G. lamblia cyst formation and thus has potential to reduce disease transmission.
Zusammenfassung
Das P-Glykoprotein (P-gp) ist ein außergewöhnlicher Membrantransporter, vor allem wegen seiner Eigenschaft, eine Vielzahl verschiedener Stoffe über die Plasmamembran befördern zu können. Aufgrund der geringen Substratpräferenz führt das Überexprimieren von P-gp zu einer gesteigerten Antibiotikaresistenz in einer Vielzahl von Zellen sowohl in Mikroorganismen als auch beim Menschen. Diese zelluläre Antibiotikaresistenz, auch „multidrug resistance“ (MDR) genannt, ist verantwortlich für einen Misserfolg bei mehr als 90% der klinischen Behandlungen von Patienten mit metastatischem Krebs aber auch bei der Behandlung von pathogenen Pilzen oder Bakterien und lebensbedrohlichen menschlichen Parasiten wie dem Malariaerreger Plasmodium. Da P-gp nicht nur in Antibiotika-resistenten, sondern auch in nicht-resistenten Zellen exprimiert wird, ist es von großem Interesse die allgemeine physiologische Funktion dieses Proteins zu verstehen. Nach dem heutigen Wissensstand wird vermutet, dass P-gp in mehreren wichtigen zellulären Prozessen involviert ist und sowohl immunologische Funktionen übernimmt als auch bei der Modellierung von Membranlipiden mitwirkt. Aufgrund der Bedeutung von P- gp bei der mikrobiellen und humanen MDR ist es von großer Wichtigkeit, die Substratspezifität, Transportaktivität und physiologische Funktion des Proteins zu verstehen – letztlich, um bei der Entwicklung von neuen Antibiotka- oder MDR- Inhibitoren zu helfen. P-gp ist vor allem in der Plasmamembran lokalisiert. Da die Plasmamembran für pathogene Organismen die erste Barriere darstellt, die für die Infektion der Wirtszelle überwunden werden muss, untersuchten wir zunächst, ob P- gp eine Funktion bei der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen übernimmt. Dabei diente der den Menschen infizierende Parasit Toxoplasma gondii, der in immunsupprimierten Individuen eine lebensbedrohliche Toxoplasmose hervorrufen kann, als Modellorganismus. Unser Projekt besaß zwei Zielsetzungen: i) die Erforschung der physiologischen Funktion von Wirtszellen P-gp und dessen Beitrag zur Wirt-Parasit-Interaktion und ii) die Charakterisierung von T. gondii P-gp und dessen Aufgabe bei der Wirt-Parasit-Interaktion. Zur Bestimmung der physiologischen Funktion von Wirtszellen P- gp und dessen Interaktion mit dem Parasiten verglichen wir drei Zelllinien mit verschiedener P-gp Expression: embryonale Mausfibroblasten vom Wildtyp (WT), P-gp „knockout“ (P- gp KO) und P-gp komplementierten (P-gp KO/P-gp) Zellen. Wir untersuchten die Rolle von P-gp bei der Parasiteninvasion, der Replikation und des Cholesteroltransports, entscheidende Prozesse für die erfolgreiche Prolongation und das Bestehen von T. gondii. Wir konnten zeigen, dass P-gp essentiell für die reguläre Replikation in T. gondii ist, da das Protein für den Cholesterintransport vom Endolysosomen des Wirtes in T. gondii gebraucht wird. Bei der Analyse einer Cholesterol-auxotrophen Replikation in T. gondii, ein Bioindikator für die Cholesterol- Homeostase in der Wirtszelle, zeigten wir insbesondere, dass P-gp eingebunden ist in den Cholesteroltransport des Wirtes vom Endolysosomen zur Plasmamembran. Zur Charakterisierung des T. gondii P-gp und dessen Funktion bei der Wirt- Parasit-Interaktion inhibierten wir pharmakologisch das P-gp des Parasiten (TgPgp) mit dem P-gp spezifischen Inhibitor GF120918 (GF). Dabei nutzen wir P- gp KO Wirtszellen, um einen Einfluss vom P-gp des Wirtes auf den Phänotyp auszuschließen. Wir analysierten die Funktion von P- gp bei der Invasion, der Replikation und beim Lipidmetabolismus des Parasiten. Es gelang aufzuzeigen, dass das Vorhandensein von P-gp in T. gondii ausschlaggebend für die Ca2+-abhängige Anheftung sowie die Invasion des Parasiten ist. Des Weiteren vermuten wir, dass TgPgp involviert ist in eine Ca2+-abhängige Signalkaskade, die wichtige Prozesse für das Überleben von T. gondii steuert. Interessanterweise ist die Funktionalität von TgPgp erforderlich für die Replikation von T. gondii und beeinflusst zudem die Lipidsynthese und den Transport des Parasiten. Zusammenfassend konnten wir in dieser Arbeit zum ersten Mal zeigen, dass sowohl das P-gp der Wirtszelle als auch das P- gp des Parasiten einen wesentlichen Einfluss auf die Wirt-Parasit-Interaktion ausübt. Der Schwerpunkt des zweiten Teils meiner Arbeit beinhaltete Untersuchungen zur epigenetischen Regulation der Entwicklungsstadien von Giardia lamblia. G. lamblia ist ein Darmparasit, der in tausenden von Menschen weltweit das Krankheitsbild der Giardiasis hervorruft. G. lamblia besiedelt den oberen Dünndarm im Menschen und anderen Vertebraten, die im Allgemeinen durch die Aufnahme von kontaminiertem Trinkwasser oder verunreinigter Nahrung mit Zysten infiziert werden. Giardia durchläuft zwei charakteristische Entwicklungsstadien: eine Lebensphase mit beweglichen, begeißelten Trophozoiten, welche für die Proliferation und die klinische Manifestation der Krankheit, wie einer Diarrhoe oder Malabsorption, entscheidend sind. Die Zysten, die infektiösen Stadien des Parasiten, bestehen aus den Trophozoiten, welche umgeben sind von einer rigiden, schützenden Zystenwand, die das Überleben und die Übertragung des Parasiten auf neue Empfänger bei externen Umweltbedingungen sichert. Die Umwandlung in verschiedene Entwicklungsstadien ist essentiell für die Übertragung und das Überleben dieses menschlichen Pathogens, dennoch wirft der molekulare Mechanismus, der diesen fundamentalen Prozess regelt, bis heute viele Fragen auf. In diesem Projekt untersuchten wir den Einfluss des Histon-Deacetylase-Inhibitors FR235222 auf die Genregulation der Stadienumwandlung im extrazellulären G. lamblia-Parasiten. Zum ersten Mal konnten wir zeigen, dass die die Inhibition der Histon-Deacetylase mit FR235222 transkriptionelle Veränderungen in beiden Entwicklungsstadien von G. lamblia induzierte und interessanterweise auch die Zystenbildung blockierte. Wir vermuten, dass die Stadienumwandlung in G. lamblia unter Kontrolle der epigenetischen Regulation und der Histon-Acetylierung steht. Hinzukommend scheint die Aktivität der Histon-Deacetylase ein hoffnungsvoller Ansatz für die Entwicklung neuer Anti- Gardia-Wirkstoffe, da die Inhibierung der Histon-Deacetylase-Aktivität die Zystenbildung in G. lamblia blockiert und daher Potential besitzt, die Übertragung der Krankheit zu reduzieren.
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Bottova, Iveta