The structural basis for the regulation of ClC chloride channels and transporters by cytoplasmic domains

Abstract

ClC chloride channels and transporters catalyze the selective flow of chloride ions across the membranes of prokaryotic and eukaryotic cells. In eukaryotes, ClC proteins play important roles in the stabilization of membrane potential, transepithelial ion transport and vesicular acidification. The unique feature of the ClC family is that it contains chloride selective channels and secondary active chloride/proton antiporters. Despite this functional diversity, the molecular architecture of the family is conserved consisting of a transmembrane transport domain and a cytoplasmic regulatory domain. Cytoplasmic domains in eukaryotic ClC proteins have been shown to be crucial for protein function and to be involved in the functional regulation of chloride transport. They have been associated with processes like the regulation of channel gating in response to ligand binding. Since the interaction between the cytoplasmic domains within the homodimeric protein is thought to be crucial for the structural basis of regulation, the aim of my PhD thesis was to reveal the oligomeric assembly of the cytoplasmic domains in eukaryotic ClC proteins. The structure of the cytoplasmic domain of the human channel ClC-Ka determined in this work has been valuable in this respect. The unusual mode of dimerization found in the crystals of the ClC-Ka domain was confirmed to be preserved in solution by combining mutagenesis, cross-linking and analytical ultracentrifugation. The complementary experiments on the ClC-0 cytoplasmic domain have shown that this domain exhibits similar structural organization and that the interaction is likely preserved in the context of the full-length ClC-0 protein. In this way, the previously ambiguous oligomeric structure of the cytoplasmic components in eukaryotic ClC proteins has been clarified. In order to relate the conformational changes in the cytoplasmic domain with the transmembrane pore, the structure of a full-length ClC protein is necessary. However, the current structural information on the ClC family exists only for the transmembrane and cytoplasmic domains in isolation. Therefore, an additional aim of my PhD thesis was to establish the overexpression and purification of a ClC protein-containing cytoplasmic domain that would serve as a model system for structural and functional studies. For that purpose, a set of prokaryotic ClC homologs containing cytoplasmic domains was identified and investigated with respect to their expression in E. coli, purification and crystallization behaviour. After extensive examination a ClC homolog from the bacterium Ralstonia metallidurans, named Rm1ClC, was selected as the only suitable for crystallization screening. Although broad crystallization attempts were performed for the full-length Rm1ClC, no crystals have been obtained possibly because of the flexible connections between the cytoplasmic domains and the transmembrane part. For that reason, the transmembrane and the cytoplasmic domain of Rm1ClC were expressed and crystallized in isolation. While the poorly diffracting crystals of the Rm1ClC transmembrane domain have not allowed its detailed structure determination, the structure of the Rm1ClC cytoplasmic domain was determined at 1.6 Ǻ resolution providing a detailed insight into the structural organization of the prokaryotic ClC cytoplasmic domain. Despite the typical CBS fold of this domain, the dimeric arrangement found to be conserved in the eukaryotic ClC proteins was not observed. The Rm1ClC domain was shown to be in a monomeric state in solution indicating at a potential different arrangement between the cytoplasmic domains in prokaryotic ClC proteins. In summary, the studies presented in this work provide the structural and biochemical information on the oligomeric assembly of the cytoplasmic components in eukaryotic and prokaryotic ClC proteins. This information will serve as the structural basis for future investigations that may reveal the mechanisms of regulation by the cytoplasmic domains in ClC chloride channels and transporters.


Die Familie der ClC Chloridkanäle und -transporter ist für die spezifische Translokation von Chloridionen über die Membran pro- und eukaryotischer Zellen verantwortlich. In Eukaryoten spielen die ClC Proteine wichtige Rollen bei der Stabilisierung des Membranpotentials, dem transepithelialen Ionentransport und der vesikulären Ansäuerung. Als Alleinstellungsmerkmal der ClC Familie kommen in dieser sowohl chloridspezifische Kanäle als auch sekundäraktive Chlorid/Proton Antiporter vor. Dieser funktionalen Vielseitigkeit steht ein konservierter, gemeinsamer Aufbau gegenüber, welcher aus einer transmembranen Transportdomäne und einer zytoplasmitschen Regulationsdomäne besteht. Die zytoplasmatischen Domänen eukaryotischer ClC Proteine sind von entscheidender Bedeutung für deren Funktion und sind an der funktionalen Regulation des Chloridtransports beteiligt. Sie wurden mit Vorgängen wie der Regulierung der Kanalaktivität durch Ligandenbindung in Verbindung gebracht. Man geht davon aus, dass diese Regulation durch die Interaktionen zwischen den zytoplasmatischen Domänen des homodimeren Proteins bewirkt wird. Daher war es das Ziel dieser Dissertation, den oligomeren Aufbau der zytoplasmatischen Domänen aufzuklären. Die Struktur der zytoplasmatischen Domäne des humanen ClC-Ka Kanals, welche im Rahmen dieser Arbeit bestimmt wurde, hat sich dabei als wertvoll erwiesen. Die Kristallstruktur der zytoplasmatischen Domäne des humanen ClC-Ka Kanals wies eine ungewöhnliche Art der Dimerisierung auf. Durch die Kombination von Mutagenese, chemischer Querverknüpfung und analytischer Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass diese ungewöhnliche Dimerisierung auch in Lösung vorliegt. Die entsprechenden ergänzenden Experimente mit der zytoplasmatischen Domäne von ClC-0 zeigten, dass diese Domäne einen vergleichbaren strukturellen Aufbau besitzt und dass diese Wechselwirkungen sehr wahrscheinlich auch beim vollständigen ClC-0 Protein auftreten. Auf diese Weise konnte der zuvor nur uneindeutig bekannte oligomere Aufbau der zytoplasmatischen Bestandteile der eukaryotischen ClC Proteine bestimmt werden. Um die Konformationsänderungen der zytoplasmatischen Domäne im Zusammenhang mit der Transmembrandomäne zu verstehen, benötigt man die Struktur eines vollständigen ClC Proteins. Derzeit kennt man jedoch nur die Strukturen von isolierten Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen der ClC Familie. Daher war es ein weiteres Ziel dieser Dissertation die Überproduktion und Reinigung eines eine zytoplasmatische Domäne enthaltendes ClC Proteins zu etablieren. Dieses sollte als Modellsystem für die strukturelle und funktionale Charakterisierung dienen. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe prokaryotischer ClC Homologe mit zytoplasmatischer Domäne bestimmt und mit Hinblick auf Expression in E. coli, Reinigung und Kristallisation untersucht. Nach genauer Überprüfung wurde RmlClC, ein ClC Homolog aus dem Bakterium Ralstonia metallidurans, als einziges für Kristallisationsexperimente geeignete Protein ausgewählt. Trotz breit gefächerter Kristallisationsversuche mit dem vollständigen RmlClC konnten keine Kristalle erhalten werden. Wahrscheinlich liegt dies an einer beweglichen Verbindung zwischen der Transmembran- und der zytoplasmatischen Domäne. Daher wurden diese Domänen getrennt exprimiert und kristallisiert. Mit den nur schlecht beugenden Kristallen der Transmembrandomäne konnte keine detaillierte Struktur bestimmt werden. Die Struktur der zytoplasmatischen Domäne konnte jedoch mit einer Auflösung von 1.6 Ǻ bestimmt werden und zeigt im Detail den strukturellen Aufbau dieser Domäne in prokaryotischen ClC Proteinen. Obwohl diese Domäne eine typische CBS Faltung aufweist, liegt nicht die in Eukaryoten konservierte dimere Anordnung vor. Es konnte gezeigt werden, dass die zytoplasmatische Domäne von RmlClC in Lösung als Monomer auftritt, was möglicherweise auf eine andere Anordung der zytoplasmatischen Domänen in prokaryotischen ClC Proteinen hinweist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen beschreiben die strukturellen und biochemischen Eigenschaften des oligomeren Aufbaus der zytoplasmatischen Bestandteile in eukaryotischen und prokaryotischen ClC Proteinen. Diese Ergebnisse werden als Grundlage für zukünftige Untersuchungen dienen, welche möglicherweise die Mechanismen der Regulierung durch die zytoplasmischen Domänen von ClC Chloridkanälen und –transportern aufzeigen.