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Artificially engineered and WRN protein bridged DNA polymerase lambda leads to improved translesion synthesis


Parasuraman, Prasanna. Artificially engineered and WRN protein bridged DNA polymerase lambda leads to improved translesion synthesis. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

ABSTRACT

DNA Polymerase (pol) λ is an X family protein sharing 32% amino acid identity to DNA pol β. Structural subdomains of DNA pol λ are similar to DNA pol β namely fingers, palm, thumb and the 8-kDa 5′-deoxyribose phosphate lyase (dRP lyase) domain. DNA pol λ has no proof reading ability since it lacks 3′→5′exonuclease activity and is known to have high affinity for deoxyribonucleosidetriphosphates (dNTPs). DNA Pol λ contains all the critical residues involved in DNA binding, nucleotide binding, nucleotide selection and catalysis of DNA polymerization. On the basis of the biochemical activity DNA pol λ is implicated in translesion DNA synthesis (TLS), base excision repair (BER) and non-homologous end joining (NHEJ). The most common lesion produced by reactive oxygen species is 7,8- dihydro-8-oxoguanine (8-oxo-G). This highly mutagenic lesion leads to G>T transversions as DNA pol λ can either incorporate dATP or dCTP opposite an 8-oxo- G lesion. DNA pol λ is very efficient in performing error-free TLS past an 8-oxo-G along with auxiliary proteins proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and replication protein A (RP-A). The auxiliary proteins PCNA and RP-A act as molecular switches to coordinate the pol selection in 8-oxo-G repair.

The aim of the thesis part 1 was to understand the role of DNA pol λ as a translesion repair enzyme over the O-6-methylguanine (O-6-mG) lesion along with auxiliary proteins PCNA and RP-A. In order to understand the role of Tyr505, the highly conserved catalytic residue over O-6-mG, we performed a single hydrophobic amino acid substitution. The data obtained lead to the conclusion that the mutation allows for an error free TLS over O-6-mG. This work contributes to the understanding that a small change in the local environment, can lead to alteration in the hydrogen-bonding pattern, thus remarkably altering the pol fidelity.

In part 2 the role of the functional interactions between the Werner syndrome protein (WRN) and DNA pol λ was investigated. Aging is associated with damage accumulation produced by reactive oxygen species (ROS) in the genome and increased cancer incidence. 8-oxo-G being the most commonly produced lesion by ROS is repaired by DNA pol λ via the BER pathway. WRN is a RECQ family of DNA helicase and is also known to be associated with an inherited diseases paving way to premature aging, increased cancer incidence and genomic instability. A specific recruitment of WRN and DNA pol λ from whole cell extracts to the A:8-oxo- G DNA template was identified in vitro and in vivo data demonstrate a functional interaction between DNA pol λ and WRN. The interacting interface of DNA pol λ was identified in its pol β like core domain. Cells exposed to oxidative stress enhanced the WRN and DNA pol λ association with a strong nuclear co-localization signal. These results present strong evidence for the involvement of WRN in oxidative DNA damage repair. ZUSAMMENFASSUNG

DNA Polymerase (Pol) λ ist ein Protein der X Familie, welches 32% Sequenzidentität mit DNA Pol β aufweist. Strukturelle Subdomänen von DNA Pol λ haben Ähnlichkeit zu den Finger-, Handfläche-, Daumen- und der 8 kDa 5'-Deoxyribosephosphat Lyase (dRP Lyase) Domänen von DNA Pol β. DNA Pol λ hat keine Korrekturfähigkeit, weil ihr die 3'->5' Exonukleaseaktivität fehlt, und sie zeigt hohe Affinität zu Desoxyribonucleosidtriphoshaten (dNTPs). Sie enthält alle notwendigen Reste, welche an der Bindung und Selektion von DNA und Nukleotiden und an der Katalyse der DNA Polymerisierung beteiligt sind. Basierend auf biochemischen Experimenten wird eine Rolle von DNA Pol λ in der Transläsions-DNA-Synthese (TLS), Basen- Exzsions Reparatur (BER) und der Verknüpfung von nichthomologen Enden vermutet. Die häufigste Läsion, welche durch reaktive Sauerstoffspezies hervorgerufen wird, ist 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxo-G). Diese höchst mutagene Läsion führt zu G>T Transversionen, weil DNA Pol λ sowohl dATP als auch dCTP im DNA Strang gegenüber der 8-oxo-G Läsion einfügen kann. Zusammen mit den Hilfsproteinen “Proliferating Cell Nuclear Antigen” (PCNA) und “Replication Protein” (RP-A) kann DNA Pol λ sehr effizient fehlerfreie TLS ausführen. Dies geschieht meist durch BER. Die beiden Hilfsproteine fungieren dabei als molekulare Schalter, welche die Selektion der DNA pol in der 8-oxo-G Reparatur koordinieren.

Das Ziel des ersten Teils dieser Doktorarbeit war die Funktion von DNA Pol λ als Reparaturenzym für die O-6-Methylguanin (O-6-mG) Läsion in Kooperation mit PCNA und RP-A zu untersuchen. Um die Rolle des höchst konservierten katalytischen Rests Tyr505 zu ergründen, wuvde wir eine einzelne hydrophobe Aminosäuresubstitution von Tyr505Met im aktiven Zentrum durchgeführt. Unsere Beobachtungen haben zum Schluss geführt, dass diese Mutation eine fehlerfreie TLS von O-6-mG erlaubt. Damit trägt diese Arbeit zur Sicht bei, dass eine kleine Veränderung, welche das Wasserstoffbrückenmuster verändert, die DNA Pol genanigkeit bemerkenswert beeinflussen kann.

Im zweiten Teil wurde wir die Rolle der funktionalen Interaktion zwischen dem Werner-Syndrom Protein (WRN) und DNA Pol λ untersucht. Das Altern ist mit einer Ansammlung von Beschädigungen des Genoms durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und einem erhöhten Auftreten von Krebserkrankungen verbunden. 8-oxo-G ist die häufigste durch ROS hervorgerufene Läsion und wird via BER von DNA Pol λ repariert. WRN ist ein Protein der RecQ Familie von DNA Helicasen und wird assoziiert mit Erbkrankheiten, welche vorzeitiges Altern, erhöhte Krebshäufigkeit und Genominstabilität hervorrufen. Eine Rekrutierung von WRN und DNA Pol λ aus Zellextrakten ans A:8-oxo-G DNA Templat konnte nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Daten zeigen eine funktionale Interaktion zwischen DNA Pol λ und WRN. Als interagierende Berührungsfläche von DNA Pol λ wurde ihre Kerndomäne identifiziert, welche Ähnlichkeit mit DNA Pol β aufweist. Zellen welche oxidativem Stress ausgesetzt sind verstärken die Assoziation zwischen WRN und DNA Pol λ, welche dabei eine starke Kolokalisation im Zellkern zeigen. Diese Resultate stellen einen starken Beweis dar für die Einbindung von WRN in der Reparatur von oxidativen Schäden an der DNA.

Abstract

ABSTRACT

DNA Polymerase (pol) λ is an X family protein sharing 32% amino acid identity to DNA pol β. Structural subdomains of DNA pol λ are similar to DNA pol β namely fingers, palm, thumb and the 8-kDa 5′-deoxyribose phosphate lyase (dRP lyase) domain. DNA pol λ has no proof reading ability since it lacks 3′→5′exonuclease activity and is known to have high affinity for deoxyribonucleosidetriphosphates (dNTPs). DNA Pol λ contains all the critical residues involved in DNA binding, nucleotide binding, nucleotide selection and catalysis of DNA polymerization. On the basis of the biochemical activity DNA pol λ is implicated in translesion DNA synthesis (TLS), base excision repair (BER) and non-homologous end joining (NHEJ). The most common lesion produced by reactive oxygen species is 7,8- dihydro-8-oxoguanine (8-oxo-G). This highly mutagenic lesion leads to G>T transversions as DNA pol λ can either incorporate dATP or dCTP opposite an 8-oxo- G lesion. DNA pol λ is very efficient in performing error-free TLS past an 8-oxo-G along with auxiliary proteins proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and replication protein A (RP-A). The auxiliary proteins PCNA and RP-A act as molecular switches to coordinate the pol selection in 8-oxo-G repair.

The aim of the thesis part 1 was to understand the role of DNA pol λ as a translesion repair enzyme over the O-6-methylguanine (O-6-mG) lesion along with auxiliary proteins PCNA and RP-A. In order to understand the role of Tyr505, the highly conserved catalytic residue over O-6-mG, we performed a single hydrophobic amino acid substitution. The data obtained lead to the conclusion that the mutation allows for an error free TLS over O-6-mG. This work contributes to the understanding that a small change in the local environment, can lead to alteration in the hydrogen-bonding pattern, thus remarkably altering the pol fidelity.

In part 2 the role of the functional interactions between the Werner syndrome protein (WRN) and DNA pol λ was investigated. Aging is associated with damage accumulation produced by reactive oxygen species (ROS) in the genome and increased cancer incidence. 8-oxo-G being the most commonly produced lesion by ROS is repaired by DNA pol λ via the BER pathway. WRN is a RECQ family of DNA helicase and is also known to be associated with an inherited diseases paving way to premature aging, increased cancer incidence and genomic instability. A specific recruitment of WRN and DNA pol λ from whole cell extracts to the A:8-oxo- G DNA template was identified in vitro and in vivo data demonstrate a functional interaction between DNA pol λ and WRN. The interacting interface of DNA pol λ was identified in its pol β like core domain. Cells exposed to oxidative stress enhanced the WRN and DNA pol λ association with a strong nuclear co-localization signal. These results present strong evidence for the involvement of WRN in oxidative DNA damage repair. ZUSAMMENFASSUNG

DNA Polymerase (Pol) λ ist ein Protein der X Familie, welches 32% Sequenzidentität mit DNA Pol β aufweist. Strukturelle Subdomänen von DNA Pol λ haben Ähnlichkeit zu den Finger-, Handfläche-, Daumen- und der 8 kDa 5'-Deoxyribosephosphat Lyase (dRP Lyase) Domänen von DNA Pol β. DNA Pol λ hat keine Korrekturfähigkeit, weil ihr die 3'->5' Exonukleaseaktivität fehlt, und sie zeigt hohe Affinität zu Desoxyribonucleosidtriphoshaten (dNTPs). Sie enthält alle notwendigen Reste, welche an der Bindung und Selektion von DNA und Nukleotiden und an der Katalyse der DNA Polymerisierung beteiligt sind. Basierend auf biochemischen Experimenten wird eine Rolle von DNA Pol λ in der Transläsions-DNA-Synthese (TLS), Basen- Exzsions Reparatur (BER) und der Verknüpfung von nichthomologen Enden vermutet. Die häufigste Läsion, welche durch reaktive Sauerstoffspezies hervorgerufen wird, ist 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxo-G). Diese höchst mutagene Läsion führt zu G>T Transversionen, weil DNA Pol λ sowohl dATP als auch dCTP im DNA Strang gegenüber der 8-oxo-G Läsion einfügen kann. Zusammen mit den Hilfsproteinen “Proliferating Cell Nuclear Antigen” (PCNA) und “Replication Protein” (RP-A) kann DNA Pol λ sehr effizient fehlerfreie TLS ausführen. Dies geschieht meist durch BER. Die beiden Hilfsproteine fungieren dabei als molekulare Schalter, welche die Selektion der DNA pol in der 8-oxo-G Reparatur koordinieren.

Das Ziel des ersten Teils dieser Doktorarbeit war die Funktion von DNA Pol λ als Reparaturenzym für die O-6-Methylguanin (O-6-mG) Läsion in Kooperation mit PCNA und RP-A zu untersuchen. Um die Rolle des höchst konservierten katalytischen Rests Tyr505 zu ergründen, wuvde wir eine einzelne hydrophobe Aminosäuresubstitution von Tyr505Met im aktiven Zentrum durchgeführt. Unsere Beobachtungen haben zum Schluss geführt, dass diese Mutation eine fehlerfreie TLS von O-6-mG erlaubt. Damit trägt diese Arbeit zur Sicht bei, dass eine kleine Veränderung, welche das Wasserstoffbrückenmuster verändert, die DNA Pol genanigkeit bemerkenswert beeinflussen kann.

Im zweiten Teil wurde wir die Rolle der funktionalen Interaktion zwischen dem Werner-Syndrom Protein (WRN) und DNA Pol λ untersucht. Das Altern ist mit einer Ansammlung von Beschädigungen des Genoms durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und einem erhöhten Auftreten von Krebserkrankungen verbunden. 8-oxo-G ist die häufigste durch ROS hervorgerufene Läsion und wird via BER von DNA Pol λ repariert. WRN ist ein Protein der RecQ Familie von DNA Helicasen und wird assoziiert mit Erbkrankheiten, welche vorzeitiges Altern, erhöhte Krebshäufigkeit und Genominstabilität hervorrufen. Eine Rekrutierung von WRN und DNA Pol λ aus Zellextrakten ans A:8-oxo-G DNA Templat konnte nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Daten zeigen eine funktionale Interaktion zwischen DNA Pol λ und WRN. Als interagierende Berührungsfläche von DNA Pol λ wurde ihre Kerndomäne identifiziert, welche Ähnlichkeit mit DNA Pol β aufweist. Zellen welche oxidativem Stress ausgesetzt sind verstärken die Assoziation zwischen WRN und DNA Pol λ, welche dabei eine starke Kolokalisation im Zellkern zeigen. Diese Resultate stellen einen starken Beweis dar für die Einbindung von WRN in der Reparatur von oxidativen Schäden an der DNA.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Lopes Massimo
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:08 Feb 2011 07:26
Last Modified:08 Feb 2019 14:57
Number of Pages:101
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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