Abstract
Reactive oxygen species (ROS) attack DNA and induce, among other lesions, about 1,000 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxo-G) alterations per cell/per day. The presence of 8-oxo-G on the replicating strand leads to frequent (10-75%) misincorporation of adenine (A) opposite a lesion (formation of A:8-oxo-G mispairs). In contrary to many other DNA damages, the A:8-oxo-G mispair is not detected by the 3’→5’ exonuclease proofreading activity of replicative DNA polymerases (pols) δ and ε, thus resulting in C:G to A:T transversion mutations. The subsequent repair mechanism allowing the removal of A and formation of C:8-oxo-G base pair is essential to prevent C:G to A:T transversion mutations. The MutY glycosylase homologue (MUTYH) is initiating the repair by recognizing A:8-oxo-G mispair and removing the A. During subsequent BER, a specialized repair DNA pol that will catalyze with high preference the accurate (incorporation of dCTP) bypass of 8-oxo-G is needed. Our laboratory has recently shown that the BER enzyme DNA pol λ, together with the auxiliary proteins replication protein A (RP-A) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA), has the unique ability among human DNA pols to efficiently incorporate a C opposite an 8-oxo-G, with error frequencies in the range of 10-3. Although these data implicated that DNA pol λ plays a key role in the repair of oxidative damage, its function in the MUTYH initiated BER has not been explored so far. In the present work an accurate BER pathway for the repair of A:8-oxo- G mispairs coordinated by MUTYH and DNA pol λ is proposed. Immunofluorescence experiments, in the cells exposed to ROS, suggest the involvement of MUTYH and DNA pol λ in the 8-oxo-G repair. Additionally, upon treatment of the cells with H2O2, a dramatic increase in protein levels of MUTYH and DNA pol λ is observed, directly indicating the activation of MUTYH/DNA pol λ-dependent repair pathway. The cross-linking assay with human whole cell extracts provides and evidence, that MUTYH, DNA pol λ, PCNA, flap endonuclease 1 (FEN1) and DNA ligases I and III are the crucial components of A:8-oxo-G repair pathway. Moreover, by using a novel 8-oxo-G specificity assay and recombinant human proteins each individual step of this repair pathway is characterized. In particular these steps are: i. the replicative enzyme DNA pol δ incorporates an incorrect dATP opposite 8-oxo-G; ii. MUTYH recognizes the A from the miscoded replication product; iii. apurinic endonuclease 1 (APE1) incises the apurinic site; iv. DNA pol λ in the presence of PCNA and RP-A efficiently incorporates the correct dCTP opposite a lesion and upon strand displacement adds an additional nucleotide; v. FEN1 cuts one nucleotide flap; vi. DNA ligase I preferentially seals the accurate (C:8-oxo-G), but not inaccurate (A:8-oxo-G) product. In summary, the data presented in this thesis suggest the existence of novel cellular response pathway to ROS, important to prevent C:G to A:T mutations formation and thereby to sustain genomic stability.
ZUSAMMENFASSUNG
Die DNS wird ständig durch reaktive Sauerstoffradikale (ROS) attackiert, welche unter anderem zur Entstehung von etwa 1’000 sogenannten 7,8-dihydro-8-oxo-Guanin (8-oxo-G) Schäden pro Zelle und Tag führen. Ein 8- oxo-G auf dem zu replizierenden DNS Strang führt häufig zum Fehleinbau von Adenin gegenüber dem 8-oxo-G Schaden, also zu A:8-oxo-G Basenpaaren. Im Gegensatz zu vielen anderen DNS Schäden wird die A:8- oxo-G Fehlpaarung nicht durch die exonukleolytische Korrekturlesefunktion der replikativen DNA-Polymerasen (pols) δ und ε erkannt, was zur Entstehung von C:G zu A:T Transversionen führen kann. Der Reparaturmechanismus, der die Entfernung von A gegenüber 8-oxo-G erlaubt, ist von höchster Wichtigkeit, um die Entstehung solcher C:G zu A:T Transversionen zu verhindern. Dieser Mechanismus wird durch die MutY Glycosylase (MUTYH) initiiert, welche das fehlgepaarte A gegenüber von 8-oxo-G erkennt und entfernt. In der daraufhin folgenden Basenexzisionsreparatur (BER) wird eine auf die DNS-Reparatur spezialisierte DNA pol, die eine hohe Präferenz für den Einbau der korrekten Base C gegenüber 8-oxo-G aufweist, gebraucht. Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass das BER Enzym DNA pol λ in Zusammenarbeit mit den Kofaktoren Replikations Protein A (RP-A) und dem Kenrantigen aus proliferierenen Zellen (PCNA), eine einzigartig hohe Präferenz für den Einbau des korrekten C gegenüber von 8-oxo-G aufweist. Die Fehlerrate von pol λ beim Einbau gegenüber von 8-oxo-G liegt im Bereich von 10-3. Obwohl diese Daten dafür sprechen, dass DNA pol λ eine Schlüsselrolle in der Reparatur von oxidativen Schäden spielt, wurde ihre Rolle in der durch MUTYH initiierten BER bisher noch nicht im Detail erforscht. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wird das Vorhandensein einer exakten BER-Maschinerie für die Reparatur von A:8-oxo-G Fehlpaarungen, die durch MUTYH und DNA pol λ koordiniert wird, vorgeschlagen. Immunfluoreszenz-Experimente in Zellen, die ROS ausgesetzt wurden, weisen auf eine Involvierung von MUTYH und DNA pol λ in der Reparatur von 8-oxo-G hin. Zusätzlich wurde eine dramatische Erhöhung der Proteinmengen von MUTYH und DNA pol λ in H2O2 behandelten Zellen beobachtet, was direkt auf die Aktivierung einer MUTYH/DNA pol λ-abhängigen Reparaturmaschinerie hinweist. Ein Experiment, in dem Proteine mit der DNS verknüpft werden zeigt, dass MUTYH, DNA pol λ, PCNA, flap endonuklease 1 (FEN1) und die DNA ligase I und III wichtige Komponenten der A:8-oxo-G Reparaturmaschinerie darstellen. Des Weiteren wurde jeder einzelne Schritt dieses Reparaturmechanismus mit Hilfe von rekombinanten menschlichen Proteinen und mittels eines neuartigen 8-oxo-G Spezifitäts-Assays charakterisiert. Im Detail sind dies die folgenden Schritte. i. Die replikative DNA pol δ inkorporiert ein inkorrektes dATP gegenüber von 8-oxo-G; ii. MUTYH erkennt und entfernt die fehlgepaarte Base A; iii. Apurinische endonuklease 1 (APE1) schneidet die apurinische Stelle ein iv. DNA pol λ inkorporiert in Zusammenarbeit mit PCNA und RP-A effizient ein korrektes C gegenüber dem Schaden und fügt nach darauf folgender Strangdislokation noch ein weiteres Nukleotid ein; v. FEN1 schneidet den um 1 Nukleotid überstehenden Strang ab; vi. DNA ligase I versiegelt bevorzugt das korrekte (C:8-oxo-G), aber nicht das inkorrekte (A:8-oxo-G) Produkt. Zusammenfassend weisen die Daten in der vorgelegten Dissertation auf die Existenz einer neuartigen zellulären Antwort auf ROS hin, welche wichtig ist, um C:G zu A:T Transversionen zu verhindern und somit die genomische Stabilität zu erhalten.
van Loon, Barbara