Abstract
Poly(ADP-ribose) polymerase 1 ist ein ubiquitär exprimiertes chromatin-assoziiertes Enzym. Es konvertiert NAD+ zu Poly(ADP-ribose), welche an PARP1 selbst, oder an anderen Proteinen gebunden wird. Die Modifikation von Proteinen mit ADP-ribose durch PARP1 führt zu Änderungen der Proteinfunktion, hauptsächlich verursacht durch die hohe negative Ladung der ADP-ribose-ketten. Für die Zelle ist es daher absolut notwendig eine fehlerlose Regulation der enzymatischen Aktivität von PARP1 zu gewährleisten. PARP1 ist involviert in vielen zellulären Prozessen, wie zum Beispiel der Transkription und der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität. Das Ziel dieser Arbeit war es die Rolle von Sumoylierung für die Funktion von PARP1 zu finden, als auch die ADP-ribosylierung von PARP1 zu erforschen. Es konnte gezeigt werden, dass PARP1 sowohl in vitro als auch in vivo mit SUMO1 und mit SUMO3 modifiziert wurde. Die Sumoylierung fand an Lysin 486 statt, innerhalb der Automodifizierungsdomäne von PARP1. Die SUMO Modifikation hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die Automodifikation von PARP1 durch ADP-ribose, aber es inhibierte die Azetylierung von benachbarten Lysinen von PARP1 durch p300. Ausserdem wies eine sumoylierungsdefiziente PARP1 Mutante einen höheren Azetylierungsstatus in vivo auf. Eine genetische Komplementation von Zellen mit Sumoylierungsdefizientem PARP1 ergab, dass die SUMO-Modifikation von PARP1 die transkriptionelle Ko-aktivatorfunktion bei spezifischen Hypoxie induzierten Genen behinderte. Weiters wurde gefunden, dass die Lysine 498, 521 und 524 von PARP1 ADP-ribosyliert werden. Dies führte zur Untersuchung von ADP-ribose Akzeptor Aminosäuren in Histonen. Die Histone H2A, H2B, H3 und H4 wurden von PARP1 und PARP10 ADP-ribosyliert. Durch den Einsatz von Punktmutationen und von Massenspektrometrie konnten Lysine am N-terminalen Histonende als ADP-ribose Akzeptor Aminosäuren identifiziert werden. Zusammenfassend zeigen diese Resultate, dass die Ko-aktivatorfunktion von PARP1 durch Sumoylierung and Azetylierung reguliert wird und dass Lysine, innerhalb von PARP1, als auch im N-terminus von Histonen, ADP-ribose akzeptorstellen sind.
Summary
Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) is an ubiquitously expressed chromatin-associated enzyme. It converts NAD+ into poly(ADP-ribose), which is then attached to PARP1 itself or to other proteins. Poly(ADP-ribosyl)ation of proteins by PARP1 leads to alterations of protein functions, mainly by the negative charge of the ADP-ribose polymers. Thus, proper regulation of the enzymatic activity of PARP1 is absolutely required for the cell. PARP1 is involved in many cellular processes, such as transcription and maintenance of the genomic stability. The aim of the thesis was to investigate whether PARP1 is sumoylated and how SUMO-modification would possibly influence the function of PARP1 in vitro and in vivo . Furthermore, we aimed to explore the ADP-ribosylation of PARP1 and other proteins, such as histones. PARP1 was found to be modified by SUMO1 and SUMO3 in vitro , as well as in vivo. The sumoylation site was located within the auto-modification domain of PARP1 at lysine 486. Interestingly, SUMO-modification of PARP1 did not affect its enzymatic activity, but instead inhibited the acetylation of adjacent lysines by p300. The sumoylation deficient PARP1 K486R mutant exhibited higher acetylation levels in vivo. Furthermore, genetic complementation of cells with a SUMO-deficient PARP1-mutant revealed that SUMO- modification of PARP1 restrained transcriptional co-activator function of certain hypoxia-inducible genes. In addition, the acetylation sites of PARP1, such as lysine 498, 521 and 524, were identified as ADP-ribose acceptor sites for the auto-modification of PARP1. This finding led to the investigation of ADP-ribose acceptor sites on histones. We found core histones H2A, H2B, H3 and H4 to be ADP-ribosylated by PARP1, as well as by PARP10. By site-directed mutagenesis and mass spectrometry, the site of modification by PARP1 was mapped to specific lysines within the N-terminal tails of the core histones. Taken together, these results reveal that the co-activator function of PARP1 is regulated through sumoylation as well as acetylation and that lysine residues functions as ADP-ribose acceptor sites within the auto-modification domain of PARP1, but also in core histone tails.
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Messner, Simon