Mechanism of poly(ADP-ribose) formation and the role of PARP1 in inflammation

Abstract

Proteins are essential components of all living organisms and participate in virtually every cellular process. Many proteins are enzymes, which catalyze very specific biochemical reactions. Protein function and enzymatic activity are often regulated by so-called post-translational modifications. An important covalent protein modification is poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation). PARylation is carried out by certain members of the protein family of poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), whose founding member is PARP1. The aim of this thesis was to investigate the molecular mechanism of PARylation and to study the function of PARP1 for pro-inflammatory gene expression. In order to study the molecular mechanism of poly(ADP-ribose) (PAR) formation, the enzymatic activities of the closely related PARP family members PARP1, PARP2 and PARP3 were characterized in vitro. By use of purified recombinant proteins and protein chimera, we found that the different protein domains of the three enzymes cooperate in a tight and very specific manner. While PARP1 and PARP2 catalyzed the formation of PAR, PARP3 only showed mono- ADP-ribosylation activity. We defined the enzymatic parameters Km and Vmax for the DNA dependent activation of PARP1 and found that lysine residues within an auto- modification loop of PARP1 are target sites for auto-ADP-ribosylation. Moreover, lysine residues in the amino-terminal basic tails of core histone molecules were identified as targets for trans-ADP-ribosylation by PARP1. Together, these results provide detailed insights into the enzymatic mechanism of PAR synthesis and challenge the traditional assumption, that PAR is attached onto glutamic acid residues. To study the contribution of PARP1 for pro-inflammatory gene expression under the control of the transcription factor NF-κB, an in vivo model system for Salmonella induced colitis was employed. In this model, PARP1 was required for efficient expression of a subset of pro-inflammatory genes and loss of PARP1 caused a delayed inflammatory host response to Salmonella infection. Thus, PARP1 was identified as a novel host factor, which, due to its transcriptional co-activator function for pro-inflammatory gene expression, accelerates Salmonella induced colitis.


ZUSAMMENFASSUNG
Proteine sind als essentielle Bestandteile aller Lebewesen an praktisch jedem zellulären Prozess beteiligt. Viele Proteine sind Enzyme, die sehr spezifische biochemische Reaktionen katalysieren. Die Funktion von Proteinen und ihre enzymatische Aktivität werden häufig durch so genannte post-translationelle Modifikationen reguliert. Eine wichtige kovalente Proteinmodifikation ist die Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung). Die PARylierung wird durch bestimmte Mitglieder der Proteinfamilie der Poly(ADP-Ribose) Polymerasen (PARPs) ausgeführt, deren Gründungsmitglied PARP1 ist. Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der PARylierung sowie die Funktion von PARP1 bei der pro-inflammatorischen Genexpression zu untersuchen. Um den molekularen Mechanismus der Synthese von Poly(ADP-Ribose) (PAR) genauer zu untersuchen, wurde die enzymatische Aktivität der eng verwandten PARP Familienmitglieder PARP1, PARP2 und PARP3 in vitro charakterisiert. Mit Hilfe von gereinigten, rekombinanten Proteinen und Proteinchimären ergab sich, dass die verschiedenen Proteindomänen der drei Enzyme sehr eng und spezifisch miteinander kooperieren. Während PARP1 und PARP2 die Synthese von PAR katalysierten, zeigte PARP3 lediglich Mono-ADP-Ribosylierungsaktivität. Wir bestimmten die enzymatischen Parameter Km und Vmax für die DNA-abhängige Aktivierung von PARP1 und erkannten, dass Lysinreste in einer Automodifikationsschleife von PARP1 als Ziel für die Auto-ADP-Ribosylierung fungieren. Darüber hinaus identifizierten wir Lysinreste in den amino-terminalen, basischen Histonausläufern als Zielaminosäuren von Trans-ADP-Ribosylierung durch PARP1. Zusammengenommen bieten diese Resultate einen detailierten Einblick in den enzymatischen Mechanismus der PAR-Synthese und hinterfragen die traditionelle Annahme, dass PAR an Glutamate angeheftet wird. Um die Beteiligung von PARP1 bei der pro-inflammatorischen Genexpression unter der Kontrolle des Transkriptionsfaktors NF-κB zu untersuchen, wurde von einem in vivo Modellsystem für Salmonellen-induzierte Kolitis Gebrauch gemacht. In diesem Modell war PARP1 notwendig für die effiziente Expression von einer Untergruppe pro-inflammatorischer Gene und der Verlust von PARP1 führte zu einer verzögerten Entzündungsreaktion nach Salmonelleninfektion. PARP1 wurde folglich als neuer Wirtsfaktor identifiziert, der wegen seiner transkriptionellen Ko- Aktivatorfunktion für pro-inflammatorische Genexpression beschleunigend wirkt auf eine Salmonellen-induzierte Kolitis.