Identification, characterization, and application of a recombinant antigen for the serological diagnosis of feline hemotropic mycoplasma infections

Abstract

Bei Feliden wurden Infektionen mit den drei hämotropen Mykoplasmen (Hämoplasmen) Mycoplasma haemofelis (Mhf), ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ (CMhm) und ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ (CMt) beschrieben. Insbesondere Mhf kann eine schwerwiegende, potentiell lebensbedrohliche hämolytische Anämie hervorrufen. Da es noch keinen serologischen Test für die Routinediagnostik feliner Hämoplasmeninfektionen gibt, war das Ziel dieser Studie, ein Mhf-Antigen (DnaK) für den Einsatz als rekombinantes Protein in solch einem Test zu identifizieren. Die Gensequenz des DnaK-Proteins wurde unter Verwendung von Konsensusprimern aus Blutproben natürlich und experimentell infizierter Katzen, sowie eines natürlich infizierten Iberischen Luchses isoliert. Das DnaK-Gen wurde anschliessend von einer E. coli- Knockout-Mutante rekombinant exprimiert und mittels Ni-Affinitäts-, Grössenausschluss- und Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt. Die biochemische und funktionelle Charakterisierung ergab, dass Mhf-DnaK typische DnaK-Mermale aufweist: Sekundärstrukturprofil, thermische Denaturierung, ATPase- Aktivität, Hitzeschockkomplementierung. Weiterhin wurde seine Immunogenität mithilfe von Seren experimentell infizierter Katzen in Westernblot- und ELISA-Tests überprüft. Das Antigen wurde von Seren mit Mhf, CMhm und CMt infizierter Tiere erkannt, während Seren naiver Tiere nicht reagierten. Dies ist die erste Beschreibung eines vollständigen, reinen, rekombinanten Antigens feliner Hämoplasmen.


In felids, three hemotropic mycoplasma species (hemoplasmas) have been described: Mycoplasma haemofelis (Mhf), ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ (CMhm), and ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’ (CMt). Particularly, Mhf may cause severe, potentially life-threatening hemolytic anemia. No routine serological assays for feline hemoplasma infections are available. Thus, the goal of this project was to identify an Mhf antigen (DnaK), to be used as a recombinant antigen in serological assays for the diagnosis of feline hemoplasma infections. The gene sequence of this protein was determined using consensus primers and blood samples from naturally and experimentally Mhf infected cats, and a naturally infected Iberian lynx (Lynx pardinus). Mhf DnaK was expressed recombinantly in an E. coli DnaK knock-out strain and purified using Ni-affinity, size exclusion, and anion exchange chromatography. It was then biochemically and functionally characterized and showed characteristics typical for DnaKs (secondary structure profile, thermal denaturation, ATPase activity, and DnaK complementation). Moreover, its immunogenicity was assessed using serum samples from experimentally hemoplasma infected cats. When the protein was applied in Western blot and enzyme-linked immunosorbent assays, it was recognized by sera from cats infected with Mhf, CMhm and CMt, respectively, but not from uninfected cats. This is the first description of a full-length purified recombinant feline hemoplasma antigen.