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Molecular mechanisms of heavy metal homeostasis in flies and humans


Günther, Viola. Molecular mechanisms of heavy metal homeostasis in flies and humans. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Ionen von essentiellen Schwermetallen, wie Zink und Kupfer, spielen eine wichtige Rolle für die Struktur und Funktion vieler zellulärer Proteine. Sind diese Schwermetalle in unzureichender Menge im Organismus vorhanden, so kommt es zu schwerwiegenden Mangelerscheinungen, die sich in einer verminderten Immunfunktion oder einer Wachstumshemmung zeigen können. Andererseits ist ein Überschuss dieser Schwermetalle schädlich. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass alle Organismen einen Weg gefunden haben, die optimale zelluläre Konzentration dieser Ionen zu gewährleisten (Homöostase). Dies wird dadurch erreicht, dass die Expression von spezifischen Importproteinen, Exportproteinen und Metallothioneinen streng reguliert wird. Metallothioneine sind kleine, cysteinreiche Proteine, die Metallionen binden und sie somit unschädlich machen. In den meisten höheren Organismen spielt der Transkriptionsfaktor „metal-responsive transkription factor-1“ (MTF-1) bei der Schwermetallhomöostase der Zelle eine zentrale Rolle. Wird die Zelle erhöhten Konzentrationen an Schwermetallionen, oxidativem Stress oder Hypoxie (unzureichende Sauerstoffversorgung) ausgesetzt, aktiviert MTF-1 die Expression von Metallothioneinen und anderen Proteinen, welche die Zelle vor Schädigungen schützen.

In der vorliegenden Arbeit charakterisieren wir die Funktion eines cysteinreichen Sequenzmotifs, welches im MTF-1 Protein aller Wirbeltiere konserviert ist und somit eine wichtige Funktion besitzen muss. Werden diese Cysteine mutiert, verliert MTF-1 weitgehend seine transkriptionelle Aktivität, kann jedoch noch an DNA binden. Hier wird in einer Reihe von Experimenten gezeigt, dass die Cysteine für die Homodimerisierung von MTF-1 notwendig sind. Die Dimerisierung von MTF-1 kann nicht durch eine Exposition der Zellen mit Zink induziert werden ist somit konstitutiv. Wir gehen davon aus, dass nur die dimere Form von MTF-1 in der Lage ist, Kofaktoren und den allgemeinen Transkriptionsapparat zu den Promotern der von MTF-1 regulierten Gene zu rekrutieren.

Die Interaktion zwischen p300 und hMTF-1 wird im zweiten Teil dieser Arbeit diskutiert. p300 ist eine sogenannte Histon-Acetyltransferase und ist Teil der generellen Transkriptionsmaschinerie. Durch Co-Immunpräzipitationsexperimente wird gezeigt das p300 und hMTF-1 miteinander interagieren und in einem zellfreien Testsystem kann eine Acetylierung von hMTF-1 durch p300 nachgewiesen werden.

Im dritten Teil dieser Arbeit werden vorläufige Ergebnisse gezeigt, die sich mit der Charakterisierung der funktionellen Domänen des MTF-1 Proteins der Fruchtfliege Drosophila (dMTF-1) befassen. Das Ziel ist es, die Proteinsegmente, welche für die transkriptionelle Aktivität, die zelluläre Lokalisation und das Erkennen von zu niedrigen oder zu hohen zellulären Metallkonzentrationen notwendig sind, zu identifizieren. In den letzten Jahren wurde in einer Reihe von Studien die Domänenstruktur des MTF-1 Proteins in Säugetieren untersucht. Eine solch umfassende Studie fehlte für dMTF-1 bisher. Die hier dargestellten Versuchsansätze und vorläufigen Ergebnisse werden zum einen Aufschluss über die Funktionsweise von dMTF-1 geben und zum anderen einen Vergleich mit der Funktionsweise des MTF-1 Proteins der Säugetiere erlauben.

Im letzen Teil untersuchen wir eine Nullmutante des Atox1 Gens im Modellorganismus Drosophila melanogaster. Atox1 ist ein sogenanntes Chaperon, welches dafür verantwortlich ist Kupferionen, welche durch die Zellmembran in die Zelle gelangen, durch das Zytoplasma zu den inneren Zellorganellen (Golgi-Apparat) zu transportieren. Von dort wird Kupfer durch Exozytose wieder aus den Zellen hinausbefördert. In den Zellen des Darms ist dieser Transportmechanismus besonders wichtig, da Kupfer auf diesem Weg in den Körper gelangt. Fehlt Atox1, akkumuliert Kupfer in den Darmzellen mit daraus resultierendem Kupfermangel im Rest des Körpers. Fliegen, welche kein Atox1 Chaperon besitzen, können sich im Gegensatz zu Wildtyp-Fliegen nicht entwickeln, wenn wenig Kupfer durch die Nahrung bereitgestellt wird. Andererseits sind diese Fliegen resistent gegen Cisplatin, ein Antikrebsmedikament, welches durch zelluläre Kupfertransportwege in den Organismus gelangt. Summary

Heavy metal ions, like Zn2+ and Cu+/2+, are important for the structure and function of many cellular proteins. If an organism is supplied with inadequate amounts of these heavy metals, it is suffering from severe deficiency syndromes, including growth retardation and a compromised immune function. On the other hand, accumulation of these ions is toxic for the organism. For these reasons every organism has to find a way to keep the concentration of essential heavy metals at an optimal level. To achieve this, the expression of metal ion importers, exporters and metallothioneins is tightly regulated. Metallothioneins are small, cysteine-rich proteins that bind metal ions and thereby detoxify the cell. In most higher organisms the metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) plays a central role in protecting the cell from the adverse effects generated by heavy metal ions as it activates the expression of metallothioneins and other cytoprotective proteins.

In this work we characterize the function of a cluster of cysteines, which is conserved in all vertebrate homologs of MTF-1. If these cysteines are mutated, MTF-1 is severely impaired in activating its target genes under normal and especially under metal-induced conditions, but is still able to bind DNA. We can show that these cysteines mediate homodimerization of MTF- 1. The dimerization of MTF-1 cannot be boosted by treating cells with zinc and rather seems to be constitutive. We suggest that only the MTF-1 dimer is able to recruit proteins of the general transcriptional machinery to the promoter region of MTF-1 target genes.

The interaction of MTF-1 and p300 will be discussed in the second part of this work. p300 is a histone acetyltransferase and is part of the general transcriptional machinery. Our data demonstrate that MTF-1 is interacting with p300 and is acetylated by p300 in a cell free test system.

The third part deals with the characterization of the functional domains of the Drosophila MTF-1 homolog (dMTF-1) and preliminary results will be shown. The aim is to identify the protein segments that mediate transcriptional activity, regulate subcellular localization of the protein, and sense heavy metal concentrations. The experiments and results presented here will elucidate regulatory mechanisms of dMTF-1 and allow a comparison with mammalian MTF-1, whose domain structure has been studied intensively over the past years.

In the last part we study a Drosophila melanogaster mutant, which lacks the Atox1 gene. Atox1 is a so called chaperone which transports copper ions from the plasma membrane to ATP7, a copper exporter. ATP7 delivers copper to proteins located in the trans-Golgi network. From there, copper is exported out of the cell via exocytosis. This route of transport is particularly important in enterocytes, where copper is taken up from the food and is provided to the organism. If Atox1 is missing, copper accumulates in the gut cells, with copper deficiency in the rest of the body as a consequence. Larvae that do not express Atox1 cannot develop under copper starvation conditions that pose no problem for wild type flies. On the other hand, these flies are resistant to the anticancer drug cisplatin, a compound whose uptake and distribution in the body is mediated by copper transport mechanisms.

Abstract

Ionen von essentiellen Schwermetallen, wie Zink und Kupfer, spielen eine wichtige Rolle für die Struktur und Funktion vieler zellulärer Proteine. Sind diese Schwermetalle in unzureichender Menge im Organismus vorhanden, so kommt es zu schwerwiegenden Mangelerscheinungen, die sich in einer verminderten Immunfunktion oder einer Wachstumshemmung zeigen können. Andererseits ist ein Überschuss dieser Schwermetalle schädlich. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass alle Organismen einen Weg gefunden haben, die optimale zelluläre Konzentration dieser Ionen zu gewährleisten (Homöostase). Dies wird dadurch erreicht, dass die Expression von spezifischen Importproteinen, Exportproteinen und Metallothioneinen streng reguliert wird. Metallothioneine sind kleine, cysteinreiche Proteine, die Metallionen binden und sie somit unschädlich machen. In den meisten höheren Organismen spielt der Transkriptionsfaktor „metal-responsive transkription factor-1“ (MTF-1) bei der Schwermetallhomöostase der Zelle eine zentrale Rolle. Wird die Zelle erhöhten Konzentrationen an Schwermetallionen, oxidativem Stress oder Hypoxie (unzureichende Sauerstoffversorgung) ausgesetzt, aktiviert MTF-1 die Expression von Metallothioneinen und anderen Proteinen, welche die Zelle vor Schädigungen schützen.

In der vorliegenden Arbeit charakterisieren wir die Funktion eines cysteinreichen Sequenzmotifs, welches im MTF-1 Protein aller Wirbeltiere konserviert ist und somit eine wichtige Funktion besitzen muss. Werden diese Cysteine mutiert, verliert MTF-1 weitgehend seine transkriptionelle Aktivität, kann jedoch noch an DNA binden. Hier wird in einer Reihe von Experimenten gezeigt, dass die Cysteine für die Homodimerisierung von MTF-1 notwendig sind. Die Dimerisierung von MTF-1 kann nicht durch eine Exposition der Zellen mit Zink induziert werden ist somit konstitutiv. Wir gehen davon aus, dass nur die dimere Form von MTF-1 in der Lage ist, Kofaktoren und den allgemeinen Transkriptionsapparat zu den Promotern der von MTF-1 regulierten Gene zu rekrutieren.

Die Interaktion zwischen p300 und hMTF-1 wird im zweiten Teil dieser Arbeit diskutiert. p300 ist eine sogenannte Histon-Acetyltransferase und ist Teil der generellen Transkriptionsmaschinerie. Durch Co-Immunpräzipitationsexperimente wird gezeigt das p300 und hMTF-1 miteinander interagieren und in einem zellfreien Testsystem kann eine Acetylierung von hMTF-1 durch p300 nachgewiesen werden.

Im dritten Teil dieser Arbeit werden vorläufige Ergebnisse gezeigt, die sich mit der Charakterisierung der funktionellen Domänen des MTF-1 Proteins der Fruchtfliege Drosophila (dMTF-1) befassen. Das Ziel ist es, die Proteinsegmente, welche für die transkriptionelle Aktivität, die zelluläre Lokalisation und das Erkennen von zu niedrigen oder zu hohen zellulären Metallkonzentrationen notwendig sind, zu identifizieren. In den letzten Jahren wurde in einer Reihe von Studien die Domänenstruktur des MTF-1 Proteins in Säugetieren untersucht. Eine solch umfassende Studie fehlte für dMTF-1 bisher. Die hier dargestellten Versuchsansätze und vorläufigen Ergebnisse werden zum einen Aufschluss über die Funktionsweise von dMTF-1 geben und zum anderen einen Vergleich mit der Funktionsweise des MTF-1 Proteins der Säugetiere erlauben.

Im letzen Teil untersuchen wir eine Nullmutante des Atox1 Gens im Modellorganismus Drosophila melanogaster. Atox1 ist ein sogenanntes Chaperon, welches dafür verantwortlich ist Kupferionen, welche durch die Zellmembran in die Zelle gelangen, durch das Zytoplasma zu den inneren Zellorganellen (Golgi-Apparat) zu transportieren. Von dort wird Kupfer durch Exozytose wieder aus den Zellen hinausbefördert. In den Zellen des Darms ist dieser Transportmechanismus besonders wichtig, da Kupfer auf diesem Weg in den Körper gelangt. Fehlt Atox1, akkumuliert Kupfer in den Darmzellen mit daraus resultierendem Kupfermangel im Rest des Körpers. Fliegen, welche kein Atox1 Chaperon besitzen, können sich im Gegensatz zu Wildtyp-Fliegen nicht entwickeln, wenn wenig Kupfer durch die Nahrung bereitgestellt wird. Andererseits sind diese Fliegen resistent gegen Cisplatin, ein Antikrebsmedikament, welches durch zelluläre Kupfertransportwege in den Organismus gelangt. Summary

Heavy metal ions, like Zn2+ and Cu+/2+, are important for the structure and function of many cellular proteins. If an organism is supplied with inadequate amounts of these heavy metals, it is suffering from severe deficiency syndromes, including growth retardation and a compromised immune function. On the other hand, accumulation of these ions is toxic for the organism. For these reasons every organism has to find a way to keep the concentration of essential heavy metals at an optimal level. To achieve this, the expression of metal ion importers, exporters and metallothioneins is tightly regulated. Metallothioneins are small, cysteine-rich proteins that bind metal ions and thereby detoxify the cell. In most higher organisms the metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) plays a central role in protecting the cell from the adverse effects generated by heavy metal ions as it activates the expression of metallothioneins and other cytoprotective proteins.

In this work we characterize the function of a cluster of cysteines, which is conserved in all vertebrate homologs of MTF-1. If these cysteines are mutated, MTF-1 is severely impaired in activating its target genes under normal and especially under metal-induced conditions, but is still able to bind DNA. We can show that these cysteines mediate homodimerization of MTF- 1. The dimerization of MTF-1 cannot be boosted by treating cells with zinc and rather seems to be constitutive. We suggest that only the MTF-1 dimer is able to recruit proteins of the general transcriptional machinery to the promoter region of MTF-1 target genes.

The interaction of MTF-1 and p300 will be discussed in the second part of this work. p300 is a histone acetyltransferase and is part of the general transcriptional machinery. Our data demonstrate that MTF-1 is interacting with p300 and is acetylated by p300 in a cell free test system.

The third part deals with the characterization of the functional domains of the Drosophila MTF-1 homolog (dMTF-1) and preliminary results will be shown. The aim is to identify the protein segments that mediate transcriptional activity, regulate subcellular localization of the protein, and sense heavy metal concentrations. The experiments and results presented here will elucidate regulatory mechanisms of dMTF-1 and allow a comparison with mammalian MTF-1, whose domain structure has been studied intensively over the past years.

In the last part we study a Drosophila melanogaster mutant, which lacks the Atox1 gene. Atox1 is a so called chaperone which transports copper ions from the plasma membrane to ATP7, a copper exporter. ATP7 delivers copper to proteins located in the trans-Golgi network. From there, copper is exported out of the cell via exocytosis. This route of transport is particularly important in enterocytes, where copper is taken up from the food and is provided to the organism. If Atox1 is missing, copper accumulates in the gut cells, with copper deficiency in the rest of the body as a consequence. Larvae that do not express Atox1 cannot develop under copper starvation conditions that pose no problem for wild type flies. On the other hand, these flies are resistant to the anticancer drug cisplatin, a compound whose uptake and distribution in the body is mediated by copper transport mechanisms.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Schaffner Walter, Hottiger Michael
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:14 Feb 2011 16:30
Last Modified:24 Sep 2019 17:24
Number of Pages:106
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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