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Establishment and application of fluorescence recovery after photobleaching to study the nuclear dynamics of DNA repair proteins


Müller, Renée. Establishment and application of fluorescence recovery after photobleaching to study the nuclear dynamics of DNA repair proteins. 2010, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

The genetic information is constantly exposed to physical and chemical DNA-damaging agents. To safeguard genome stability, nucleotide excision repair (NER) is a protective system that processes a wide diversity of structurally unrelated DNA lesions, including UV-induced photoproducts and cisplatin intrastrand crosslinks. The aim of this thesis was to establish novel fluorescent protein-based imaging techniques to study NER activity in living fibroblasts and to apply these methods to determine the mechanism by which low-dose formaldehyde, a widely used genotoxic chemical, inhibits DNA repair. The nuclear movements of NER factors were analyzed by measuring the kinetics of accumulation at lesion sites and by monitoring protein dynamics in fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments. In combination, this live-cell imaging approach reveals that formaldehyde, at noncytotoxic concentrations, impedes the intra-nuclear trafficking of the DNA damage recognition proteins DDB2 and XPC, thus retarding their recruitment to NER substrates. Further live-cell imaging experiments with fluorescently tagged ubiquitin suggest that DDB2 stimulates protein ubiquitylation in response to formaldehyde exposure. In conclusion, these findings indicate that formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks interfere with the normal trafficking of NER subunits, thus distracting these repair factors from their physiologic function in recognizing and processing mutagenic DNA lesions.

ZUSAMMENFASSUNG
Die genetische Information wird ständig verschiedenen physikalischen und chemischen Einflüssen ausgesetzt, die zur Schädigung der DNA führen. Um das Genom zu schützen, prozessiert die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) eine große Vielfalt von nicht verwandten DNA-Addukten, einschließlich solche die zum Beispiel durch UV-Licht oder Cisplatin hervorgerufen werden. Das Ziel dieser Arbeit war, die entsprechenden Reparaturproteine mittels Fluoreszenz so zu markieren, dass deren Aktivität in lebenden Fibroblasten untersucht werden kann. Mit dieser Methode soll die Wirkung von Formaldehyd, ein weit verbreitetes genotoxisches Agens, auf die NER-Reaktion geprüft werden. Für die Bestimmung der intrazellulären Aktivität der Reparaturproteine wurden die Kinetik ihrer Ansammlung an Schadstellen und ihre Dynamik in „fluorescence recovery“ Experimenten ermittelt. Diese Echtzeit - Untersuchungen ergaben, dass Formaldehyd schon in niedrigen, nicht-zytotoxischen Konzentrationen die nukleäre Beweglichkeit der XPC- und DDB2- Erkennungsproteine einschränkt, womit ihre Rekrutierung an Schadstellen verlangsamt wird. Weitere Echtzeit-Versuche mit fluoreszenzmarkiertem Ubiquitin weisen darauf hin, dass DDB2 die Protein-Ubiquitylierung in Folge der Einwirkung von Formaldehyd stimuliert. Somit zeigen unsere Untersuchungen, dass formaldehydinduzierte Vernetzungen die Aktivität der NER-Faktoren behindern und auf dieser Weise die Exzisionsreparatur von mutagenen DNA-Schäden beinträchtigen.

Abstract

The genetic information is constantly exposed to physical and chemical DNA-damaging agents. To safeguard genome stability, nucleotide excision repair (NER) is a protective system that processes a wide diversity of structurally unrelated DNA lesions, including UV-induced photoproducts and cisplatin intrastrand crosslinks. The aim of this thesis was to establish novel fluorescent protein-based imaging techniques to study NER activity in living fibroblasts and to apply these methods to determine the mechanism by which low-dose formaldehyde, a widely used genotoxic chemical, inhibits DNA repair. The nuclear movements of NER factors were analyzed by measuring the kinetics of accumulation at lesion sites and by monitoring protein dynamics in fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments. In combination, this live-cell imaging approach reveals that formaldehyde, at noncytotoxic concentrations, impedes the intra-nuclear trafficking of the DNA damage recognition proteins DDB2 and XPC, thus retarding their recruitment to NER substrates. Further live-cell imaging experiments with fluorescently tagged ubiquitin suggest that DDB2 stimulates protein ubiquitylation in response to formaldehyde exposure. In conclusion, these findings indicate that formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks interfere with the normal trafficking of NER subunits, thus distracting these repair factors from their physiologic function in recognizing and processing mutagenic DNA lesions.

ZUSAMMENFASSUNG
Die genetische Information wird ständig verschiedenen physikalischen und chemischen Einflüssen ausgesetzt, die zur Schädigung der DNA führen. Um das Genom zu schützen, prozessiert die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) eine große Vielfalt von nicht verwandten DNA-Addukten, einschließlich solche die zum Beispiel durch UV-Licht oder Cisplatin hervorgerufen werden. Das Ziel dieser Arbeit war, die entsprechenden Reparaturproteine mittels Fluoreszenz so zu markieren, dass deren Aktivität in lebenden Fibroblasten untersucht werden kann. Mit dieser Methode soll die Wirkung von Formaldehyd, ein weit verbreitetes genotoxisches Agens, auf die NER-Reaktion geprüft werden. Für die Bestimmung der intrazellulären Aktivität der Reparaturproteine wurden die Kinetik ihrer Ansammlung an Schadstellen und ihre Dynamik in „fluorescence recovery“ Experimenten ermittelt. Diese Echtzeit - Untersuchungen ergaben, dass Formaldehyd schon in niedrigen, nicht-zytotoxischen Konzentrationen die nukleäre Beweglichkeit der XPC- und DDB2- Erkennungsproteine einschränkt, womit ihre Rekrutierung an Schadstellen verlangsamt wird. Weitere Echtzeit-Versuche mit fluoreszenzmarkiertem Ubiquitin weisen darauf hin, dass DDB2 die Protein-Ubiquitylierung in Folge der Einwirkung von Formaldehyd stimuliert. Somit zeigen unsere Untersuchungen, dass formaldehydinduzierte Vernetzungen die Aktivität der NER-Faktoren behindern und auf dieser Weise die Exzisionsreparatur von mutagenen DNA-Schäden beinträchtigen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Naegeli Hanspeter, Luch Andreas
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Veterinary Pharmacology and Toxicology
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:18 Feb 2011 15:39
Last Modified:15 Apr 2021 14:12
Number of Pages:73
OA Status:Green

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