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Neuroprotective effects of Complement C3 convertase inhibition after traumatic brain injury : a randomized placebo-controlled study in mice


Taha, Mohyeldin Abdelhady. Neuroprotective effects of Complement C3 convertase inhibition after traumatic brain injury : a randomized placebo-controlled study in mice. 2010, University of Zurich, Faculty of Medicine.

Abstract

Zusammenfassung meiner medizinischen Doktorarbeit in der Abteilung Unfall- und Wiederherstellungschirurgie im Labor für Experimentelle Neurotraumatologie mit dem Titel:

„Neuroprotective effects of Complement C3 convertase inhibition after Traumatic brain injury a randomized placebo-controlled study in mice“

Wir haben im speziellen die molekularen Mechanismen des Schädel-Hirn-Taumas mit Bezug auf die Bedeutung der Komplement-vermittelten Neuroinflammation und sekundären Neurodegeneration, basierend auf einem etablierten experimentellen Modell in der Maus untersucht.

Im Rahmen des Projektes haben wir proteinanalytische Techniken, Gelelektrophoresen und Western Blots durchgeführt.

Verschiedene Forschungsgruppen haben in den vergangenen Jahrzehnten die Rolle der massiven intrakraniellen inflammatorischen Antwort im verletzten Hirn untersucht, im Hinblick auf die neuropathologischen Folgen, welche zu grossem Anteil verantwortlich sind für das ungünstige „Outcome“ in Patienten mit Schädelhirntrauma.

Wir haben in unserer Arbeit folgendes untersucht: Den Effekt von pharmakologischer Komplement Inhibition der C3 Convertase (durch Crry-Ig) auf Apoptose, neuronalen Zelltod und Komplement Aktivierung nach Kopfverletzung (im Experiment). Unser spezieller Fokus war das antiapoptotische Bcl-2 Protein und das proapoptotische Bax Protein.

Nach dem Trauma zeigten die Gene für C1-Inh und CD55 innert 4 Stunden in der Crry-Ig- injziierten Gruppe eine signifikante Hochregulierung, im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Genexprimierung wurde durch eine semiquantitative „two-step real-time“ RT-PCR ermittelt. Das CD59 Gen zeigte eine leicht unterschiedliche Kinetik mit einem Peak bei 24 Stunden, während das CD55 Gen bis zu 7 Tage nach dem Schädelhirntrauma signifikant erhöht blieb, verglichen mit der Kontrollgruppe. Dagegen war das C1-Inh Gen signifikant supprimiert zu den späteren Zeitpunkten (24h und 7 Tage) verglichen zur Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Crry-Ig seine anti-Komplement Effekte nicht nur durch direkte Inhibition von C3 Convertasen moduliert.

Wir identifizierten eine posttraumatische Hochregulierung von Bcl-2 mRNA innert 7 Tagen, welche in der Crry-Ig behandelten Gruppe bereits 4 Stunden nach dem Trauma induziert wurde; begleitet von einer Erhöhung in der intrazerebralen Bcl-2 Expression.

Interessanterweise wurde Bax mRNA ebenfalls hervorgerufen nach der Beifügung von Crry-Ig. Die Bax Expression war zwar erhöht, aber der Bax/Bcl-2 Ratio suggeriert eine Neuroprotektion. Dies wurde durch eine anti NeuN antibody Färbung bestätigt, welche Anzeichen für eine Neuroprotektion im Hippocampus hervorbrachte und durch TUNEL Histochemie, welche eine tiefere Anzahl von TUNEL positiven Zellen in Crry-Ig behandelten Mäusen zeigte versus der Kontrollgruppe.

Zusammenfassend denken wir, dass eine effektive pharmakologische Inhibition der intrazerebralen Komplement Aktivierung dazu beitragen sollte, erfolgreich die sekundäre Hirnverletzung abzuschwächen und helfen kann, die hohe Rate an neurologischer Morbidität und Mortalität bei Neurotrauma Patienten zu reduzieren. 1. Summary Despite the fact that neurological diseases of other etiologies receive more attention by the media, biomedical research and supporting foundations in industrialized countries, TBI still remains the leading cause of death in young individuals up to the age of 40 years. Research efforts in the past decade have focused on elucidating the role of the massive intracranial inflammatory response in the injured brain with regard to the neuropathological sequelae which are, in large part, responsible for the adverse outcome in neurotrauma patients. In the present study, we have investigated the effect of pharmacological complement inhibition at the C3 convertase (by Crry-Ig) on apoptosis, neuronal cell death and complement activation after experimental head injury, with a special focus on the anti- apoptotic Bcl-2 protein and pro-apoptotic Bax protein. After trauma, the genes for C1-Inh and CD55 were significantly upregulated within 4h in the Crry-Ig-injected group, as compared to vehicle-injected controls. The genes’ expression was assessed using a semi quantitative two-step real-time RT-PCR. The CD59 gene showed a slightly differing kinetic with a peak at 24 h, whereas the CD55 gene remained significantly elevated above the vehicle controls for up to 7 days after TBI. In contrast, the C1-Inh gene was significantly suppressed at the later time-points (24h and 7 days) compared to vehicle-injected mice. These data suggest that Crry-Ig modulates its anti-complement effects not only by direct inhibition of C3 convertases. We identified a posttraumatic upregulation of Bcl-2 mRNA within 7 days, which was further induced in the Crry-Ig-treated group as early as 4h after trauma associated by an increase in intracerebral Bcl-2 expression, which was confirmed at the protein level by Western blot analysis. Interestingly, Bax mRNA was also provoked after introduction of Crry-Ig and Bax expression was increased but the Bax/Bcl-2 ratio was suggestible in favour of neuroprotection. This was confirmed by anti NeuN antibody stain which revealed neuroprotective signs in hippocampus and TUNEL histochemistry showing lower number of TUNEL positive cells in Crry-Ig treated mice vs. vehicle-treated mice. In conclusion, an effective pharmacological inhibition of the intracerebral complement activation, should provide a future avenue for successful attenuation of secondary brain injury, and may hopefully help reduce the high rate of neurological morbidity and delayed mortality in neurotrauma patients.

Abstract

Zusammenfassung meiner medizinischen Doktorarbeit in der Abteilung Unfall- und Wiederherstellungschirurgie im Labor für Experimentelle Neurotraumatologie mit dem Titel:

„Neuroprotective effects of Complement C3 convertase inhibition after Traumatic brain injury a randomized placebo-controlled study in mice“

Wir haben im speziellen die molekularen Mechanismen des Schädel-Hirn-Taumas mit Bezug auf die Bedeutung der Komplement-vermittelten Neuroinflammation und sekundären Neurodegeneration, basierend auf einem etablierten experimentellen Modell in der Maus untersucht.

Im Rahmen des Projektes haben wir proteinanalytische Techniken, Gelelektrophoresen und Western Blots durchgeführt.

Verschiedene Forschungsgruppen haben in den vergangenen Jahrzehnten die Rolle der massiven intrakraniellen inflammatorischen Antwort im verletzten Hirn untersucht, im Hinblick auf die neuropathologischen Folgen, welche zu grossem Anteil verantwortlich sind für das ungünstige „Outcome“ in Patienten mit Schädelhirntrauma.

Wir haben in unserer Arbeit folgendes untersucht: Den Effekt von pharmakologischer Komplement Inhibition der C3 Convertase (durch Crry-Ig) auf Apoptose, neuronalen Zelltod und Komplement Aktivierung nach Kopfverletzung (im Experiment). Unser spezieller Fokus war das antiapoptotische Bcl-2 Protein und das proapoptotische Bax Protein.

Nach dem Trauma zeigten die Gene für C1-Inh und CD55 innert 4 Stunden in der Crry-Ig- injziierten Gruppe eine signifikante Hochregulierung, im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Genexprimierung wurde durch eine semiquantitative „two-step real-time“ RT-PCR ermittelt. Das CD59 Gen zeigte eine leicht unterschiedliche Kinetik mit einem Peak bei 24 Stunden, während das CD55 Gen bis zu 7 Tage nach dem Schädelhirntrauma signifikant erhöht blieb, verglichen mit der Kontrollgruppe. Dagegen war das C1-Inh Gen signifikant supprimiert zu den späteren Zeitpunkten (24h und 7 Tage) verglichen zur Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Crry-Ig seine anti-Komplement Effekte nicht nur durch direkte Inhibition von C3 Convertasen moduliert.

Wir identifizierten eine posttraumatische Hochregulierung von Bcl-2 mRNA innert 7 Tagen, welche in der Crry-Ig behandelten Gruppe bereits 4 Stunden nach dem Trauma induziert wurde; begleitet von einer Erhöhung in der intrazerebralen Bcl-2 Expression.

Interessanterweise wurde Bax mRNA ebenfalls hervorgerufen nach der Beifügung von Crry-Ig. Die Bax Expression war zwar erhöht, aber der Bax/Bcl-2 Ratio suggeriert eine Neuroprotektion. Dies wurde durch eine anti NeuN antibody Färbung bestätigt, welche Anzeichen für eine Neuroprotektion im Hippocampus hervorbrachte und durch TUNEL Histochemie, welche eine tiefere Anzahl von TUNEL positiven Zellen in Crry-Ig behandelten Mäusen zeigte versus der Kontrollgruppe.

Zusammenfassend denken wir, dass eine effektive pharmakologische Inhibition der intrazerebralen Komplement Aktivierung dazu beitragen sollte, erfolgreich die sekundäre Hirnverletzung abzuschwächen und helfen kann, die hohe Rate an neurologischer Morbidität und Mortalität bei Neurotrauma Patienten zu reduzieren. 1. Summary Despite the fact that neurological diseases of other etiologies receive more attention by the media, biomedical research and supporting foundations in industrialized countries, TBI still remains the leading cause of death in young individuals up to the age of 40 years. Research efforts in the past decade have focused on elucidating the role of the massive intracranial inflammatory response in the injured brain with regard to the neuropathological sequelae which are, in large part, responsible for the adverse outcome in neurotrauma patients. In the present study, we have investigated the effect of pharmacological complement inhibition at the C3 convertase (by Crry-Ig) on apoptosis, neuronal cell death and complement activation after experimental head injury, with a special focus on the anti- apoptotic Bcl-2 protein and pro-apoptotic Bax protein. After trauma, the genes for C1-Inh and CD55 were significantly upregulated within 4h in the Crry-Ig-injected group, as compared to vehicle-injected controls. The genes’ expression was assessed using a semi quantitative two-step real-time RT-PCR. The CD59 gene showed a slightly differing kinetic with a peak at 24 h, whereas the CD55 gene remained significantly elevated above the vehicle controls for up to 7 days after TBI. In contrast, the C1-Inh gene was significantly suppressed at the later time-points (24h and 7 days) compared to vehicle-injected mice. These data suggest that Crry-Ig modulates its anti-complement effects not only by direct inhibition of C3 convertases. We identified a posttraumatic upregulation of Bcl-2 mRNA within 7 days, which was further induced in the Crry-Ig-treated group as early as 4h after trauma associated by an increase in intracerebral Bcl-2 expression, which was confirmed at the protein level by Western blot analysis. Interestingly, Bax mRNA was also provoked after introduction of Crry-Ig and Bax expression was increased but the Bax/Bcl-2 ratio was suggestible in favour of neuroprotection. This was confirmed by anti NeuN antibody stain which revealed neuroprotective signs in hippocampus and TUNEL histochemistry showing lower number of TUNEL positive cells in Crry-Ig treated mice vs. vehicle-treated mice. In conclusion, an effective pharmacological inhibition of the intracerebral complement activation, should provide a future avenue for successful attenuation of secondary brain injury, and may hopefully help reduce the high rate of neurological morbidity and delayed mortality in neurotrauma patients.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Simmen Hans-Peter, Simmen H -P
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:21 Feb 2011 16:53
Last Modified:24 Sep 2019 17:26
Number of Pages:76
Additional Information:Neuroprotective effects of Complement C3 convertase inhibition after traumatic brain injury : a randomized placebo-controlled study in mice / vorgelegt von Mohyeldin Abdelhady Taha. - Zürich, 2010
OA Status:Green
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