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Lipoprotein localization signals and evaluation of novel drug targets to combat tuberculosis


Grau, Thomas. Lipoprotein localization signals and evaluation of novel drug targets to combat tuberculosis. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

SUMMARY 1



Summary With more than 9 million new cases and nearly 2 million deaths per year, Tuberculosis still remains a major global burden. The causative agent of the disease, Mycobacterium tuberculosis, belongs to the group of slow growing, GC-rich Gram-positive bacteria. Mycobacteria in general are characterized by a unique cell envelope, which forms a barrier for uptake of numerous chemical compounds. Therefore, treatment of Tuberculosis is naturally lenghty and complex. Recently an increase in drug resistant or multidrug-resistant (MDR) Tuberculosis has been observed. MDR is due to acquired mutations in several genes, conferring resistance to a wide spectrum of antibiotics. Even though M. tuberculosis has been described a century ago, the complete mechanisms of infection and virulence are not yet fully understood. Upon inhaling droplets containing M. tuberculosis, the bacterium is able to survive in lung alveolar macrophages and to persist in the body for decades. A class of secreted proteins, the so called lipoproteins, have been shown to be involved in several processes of these host-pathogen interactions. The aims of this study were 1) the characterization of the transport of lipoproteins to the cell wall of mycobacteria and 2) the evaluation of potential new drug targets to fight Tuberculosis including the enhancement of mycobacterial drugs used nowadays. In order to investigate the transport of lipoproteins to the cell wall of mycobacteria, several lipoproteins of M. tuberculosis have been expressed in Mycobacterium smegmatis, a mycobacterial model organism. Using subcellular fractionation techniques, these reporter proteins were localized either in the cytoplasmic membrane or in the cell wall. Lipoproteins are defined by the so called lipobox at the N-terminus, which contains in its mature form a universally conserved and lipidated cysteine. In Escherichia coli, the very well characterized Gram-negative bacterium, lipoproteins are transported from the inner membrane to the outer membrane by the Lol-system, unless they contain a retention signal located at position +2 after the cysteine. As mycobacteria miss a transporter similar to the Lol-system, transport and signal sequences for transport of lipoproteins to the cell wall remain unclear. By site-directed mutagenesis, several hybrid lipoprotein reporter constructs have been generated, expressed in M. smegmatis and subjected to subcellular fractionation. The results of these experiments indicate that a region of 10 amino acids subsequent to the cysteine of the lipobox acts as a positive signal for the transport to the cell wall.

The standard treatment to fight Tuberculosis consits of a combination of several first- line drugs. With the rise of multidrug-resistant strains of M. tuberculosis (MDR-TB), second- SUMMARY 2

line drugs have been brought back into focus. These antibiotics are second choice beause of either a difficult mode of application (injectable drugs) or are more toxic and cause severe side-effects. One of those second-line drugs is ethionamide (ETH) which is a prodrug and thus has to be activated within the bacterium. The activation is performed by the enzyme EthA, which is naturally repressed by EthR. By screening of a chemical compound library generated by a synthetic mammalian gene circuit, the substance 2-phenylethyl-butyrate (2- PEB) was found to release EthR efficiently. This study shows by applying drug susceptibility testing, that the combination of 2-PEB and ETH has a synergistic effect on growth of mycobacteria, even on MDR-strains. Therefore we could show that ETH can be applied in sub-inhibitory concentrations against M. tuberculosis, which in turn could reduce the potential side-effects of this important second-line drug.

The last part of this work evaluates a new promising class of antibiotics, the NAD- synthetase inhibitors. NAD+ is a coenzyme involved in redox reactions in all living cells. In contrast to humans, where an NAD-synthetase-independent recycling pathway exists, the biosynthesis of NAD+ in M. tuberculosis is absolutely dependent on the activity of NAD- synthetase. Screening of compounds with proven inhibition of mycobacterial NAD-synthetase in a biochemical assay identified one promising compound inhibiting growth of M. tuberculosis. Thus, this new class of antibiotics raises hope for new possibilities to fight Tuberculosis. SUMMARY 3



Mit mehr als 9 Millionen Neuinfektionen und annähernd 2 Millionen Todesfällen pro Jahr ist die Tuberkulose immer noch ein Problem mit globaler Tragweite. Der Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis, gehört der Gruppe der langsam wachsenden, mit einem hohen GC-Anteil versehenen Gram-positiven Bakterien an. Mykobakterien im Allgemeinen sind mit einer einzigartigen äusseren Hülle ausgestattet, welche eine natürliche Schranke gegen die Aufnahme einer ganzen Reihe von chemischen Substanzen darstellt. Dies ist der Grund weshalb die Behandlung der Tuberkulose langwierig und komplex ist. Seit einiger Zeit wird ein Anstieg von Infektionen mit resistenten oder gar multiresistenten Tuberkulosestämmen beobachtet. Multiresistenz ist auf mehrere erworbene Mutationen in unterschiedlichen Genen zurückzuführen. Obwohl der Tuberkuloseerreger bereits vor einem Jahrhundert entdeckt und beschrieben wurde, sind wir von einem vollständigen Verständnis der Infektion und der Virulenzmechanismen von M. tuberculosis weit entfernt. Nach einer Tröpfcheninfektion mit M. tuberculosis gelingt es dem Bakterium in den Makrophagen der Lungenalveolen zu überleben und teilweise für Jahrzehnte im Körper zu persistieren. Es wurde gezeigt, dass eine spezielle Klasse von Proteinen, die Lipoproteine; in verschiedenen Prozessen der Wirt-Pathogen Interaktionen beteiligt sind. Das Ziel dieser Studie ist 1) die Untersuchung des Transports von Lipoproteinen zur mykobakteriellen Zellwand sowie die Charakterisierung spezifischer Lipoproteine auf molekularer Ebene und 2) die Evaluation neuer antibiotischer Zielstrukturen und neuer Antibiotika sowie die Verstärkung der Wirkung bestehender Antibiotika.

Zur Untersuchung des Transports von Lipoproteinen zur Zellwand von Mykobakterien, wurden verschiedene Lipoproteine von M. tuberculosis in M. smegmatis, einem mykobakteriellen Modell-Organismus, exprimiert. Mit der Hilfe von subzellulären Fraktionierungstechniken konnten diese Reporterproteine entweder in der Cytoplas- mamembran oder in der Zellwand lokalisiert werden. Lipoproteine enthalten in ihrer maturen Form ein universell konserviertes und lipidiertes Cystein. In dem sehr gut untersuchten, Gram-negativen Bakterium Escherichia coli werden Lipoproteine durch das Lol-System zur äusseren Membran transportiert und verankert. Ein Rückhaltesignal, ein Asp an der Position +2 nach dem Cystein bewirkt, dass bestimmte Lipoproteine in der Plasmamembran verankert bleiben. Da Mykobakterien kein dem Lol-system entsprechendes Transportsystem besitzen, ist es wahrscheinlich, dass ihre Lipoproteine auch ein anderes Transportsignal besitzen. In SUMMARY 4

dieser Studie wurden durch gezielte Mutationen verschiedene artifizielle Reporterlipoproteine generiert, in M. smegmatis exprimiert und ihre Lokalisation mittels Fraktionierung untersucht. Die Resultate dieser Experimente zeigen, dass eine Region von 10 Aminosäuren unmittelbar C-terminal des Cysteins der Lipobox als ein positives Transportsignal dient.

Die aktuelle Standardtherapie zur Behandlung der Tuberkulose besteht aus einer Kombination mehrerer Antibiotika der ersten Wahl. Mit dem gehäuften Auftreten mehrfach medikamentenresistenter Stämme von M. tuberculosis, rücken die Medikamente der zweiten Wahl immer mehr in den Fokus. Aufgrund ihrer zum Teil schwierigeren Verabreichungsmethode (Injektion) und ihren grösseren Nebenwirkungen gelten diese Medikamente als zweite Wahl. Eines dieser Antibiotika ist Ethionamid. Ethionamid wird als ein Vorläufer verabreicht und muss, um seinen antibakteriellen Effekt zu entfalten, im Bakterium aktiviert werden. Dieser Vorgang wird von dem mykobakteriellen Enzym EthA katalysiert, dessen Expression von seinem natürlichen Repressor EthR vermindert wird. Durch systematisches Screening einer Sammlung chemischer Substanzen wurde 2- Phenylethyl-butyrat (2-PEB) entdeckt, welches die Fähigkeit hat, EthR von dem ethA/ethR- Operon abzulösen. Die hier vorliegende Studie zeigt mittels Medikamenten- Suszeptibilitätstests, dass die Kombination von 2-PEB und ETH einen synergistischen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von Mykobakterien hat, sogar auf Stämme mit Antibiotikaresistenzen. Durch die Zugabe von 2-PEB konnte somit die minimale Hemmkonzentration gesenkt werden.

Der letzte Teil dieser Arbeit widmet sich neuen möglichen Antibiotika zur Behandlung der Tuberkulose. Es handelt sich hierbei um eine Klasse von NAD-Synthetase Inhibitoren. NAD+ ist ein Coenzym, welches an Redox-Reaktionen in allen lebenden Zellen beteiligt ist. Im Gegensatz zu den Menschen, welche einen Recyclingweg für NAD+ besitzen, ist die Synthese von NAD+ in Bakterien vollständig von einer funktionellen NAD-Synthetase abhängig. Substanzen, welche in einem biochemischen Test die M. tuberculosis-NAD- Synthetase inhibierten, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, das Wachstum von M. tuberculosis zu hemmen. Eine der getesteten Substanzen zeigt eine vielversprechende Wirkung gegen M. tuberculosis. Diese neue Klasse von Antibiotika gibt Anlass zur Hoffnung im Kampf gegen die Tuberkulose.

Abstract

SUMMARY 1



Summary With more than 9 million new cases and nearly 2 million deaths per year, Tuberculosis still remains a major global burden. The causative agent of the disease, Mycobacterium tuberculosis, belongs to the group of slow growing, GC-rich Gram-positive bacteria. Mycobacteria in general are characterized by a unique cell envelope, which forms a barrier for uptake of numerous chemical compounds. Therefore, treatment of Tuberculosis is naturally lenghty and complex. Recently an increase in drug resistant or multidrug-resistant (MDR) Tuberculosis has been observed. MDR is due to acquired mutations in several genes, conferring resistance to a wide spectrum of antibiotics. Even though M. tuberculosis has been described a century ago, the complete mechanisms of infection and virulence are not yet fully understood. Upon inhaling droplets containing M. tuberculosis, the bacterium is able to survive in lung alveolar macrophages and to persist in the body for decades. A class of secreted proteins, the so called lipoproteins, have been shown to be involved in several processes of these host-pathogen interactions. The aims of this study were 1) the characterization of the transport of lipoproteins to the cell wall of mycobacteria and 2) the evaluation of potential new drug targets to fight Tuberculosis including the enhancement of mycobacterial drugs used nowadays. In order to investigate the transport of lipoproteins to the cell wall of mycobacteria, several lipoproteins of M. tuberculosis have been expressed in Mycobacterium smegmatis, a mycobacterial model organism. Using subcellular fractionation techniques, these reporter proteins were localized either in the cytoplasmic membrane or in the cell wall. Lipoproteins are defined by the so called lipobox at the N-terminus, which contains in its mature form a universally conserved and lipidated cysteine. In Escherichia coli, the very well characterized Gram-negative bacterium, lipoproteins are transported from the inner membrane to the outer membrane by the Lol-system, unless they contain a retention signal located at position +2 after the cysteine. As mycobacteria miss a transporter similar to the Lol-system, transport and signal sequences for transport of lipoproteins to the cell wall remain unclear. By site-directed mutagenesis, several hybrid lipoprotein reporter constructs have been generated, expressed in M. smegmatis and subjected to subcellular fractionation. The results of these experiments indicate that a region of 10 amino acids subsequent to the cysteine of the lipobox acts as a positive signal for the transport to the cell wall.

The standard treatment to fight Tuberculosis consits of a combination of several first- line drugs. With the rise of multidrug-resistant strains of M. tuberculosis (MDR-TB), second- SUMMARY 2

line drugs have been brought back into focus. These antibiotics are second choice beause of either a difficult mode of application (injectable drugs) or are more toxic and cause severe side-effects. One of those second-line drugs is ethionamide (ETH) which is a prodrug and thus has to be activated within the bacterium. The activation is performed by the enzyme EthA, which is naturally repressed by EthR. By screening of a chemical compound library generated by a synthetic mammalian gene circuit, the substance 2-phenylethyl-butyrate (2- PEB) was found to release EthR efficiently. This study shows by applying drug susceptibility testing, that the combination of 2-PEB and ETH has a synergistic effect on growth of mycobacteria, even on MDR-strains. Therefore we could show that ETH can be applied in sub-inhibitory concentrations against M. tuberculosis, which in turn could reduce the potential side-effects of this important second-line drug.

The last part of this work evaluates a new promising class of antibiotics, the NAD- synthetase inhibitors. NAD+ is a coenzyme involved in redox reactions in all living cells. In contrast to humans, where an NAD-synthetase-independent recycling pathway exists, the biosynthesis of NAD+ in M. tuberculosis is absolutely dependent on the activity of NAD- synthetase. Screening of compounds with proven inhibition of mycobacterial NAD-synthetase in a biochemical assay identified one promising compound inhibiting growth of M. tuberculosis. Thus, this new class of antibiotics raises hope for new possibilities to fight Tuberculosis. SUMMARY 3



Mit mehr als 9 Millionen Neuinfektionen und annähernd 2 Millionen Todesfällen pro Jahr ist die Tuberkulose immer noch ein Problem mit globaler Tragweite. Der Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis, gehört der Gruppe der langsam wachsenden, mit einem hohen GC-Anteil versehenen Gram-positiven Bakterien an. Mykobakterien im Allgemeinen sind mit einer einzigartigen äusseren Hülle ausgestattet, welche eine natürliche Schranke gegen die Aufnahme einer ganzen Reihe von chemischen Substanzen darstellt. Dies ist der Grund weshalb die Behandlung der Tuberkulose langwierig und komplex ist. Seit einiger Zeit wird ein Anstieg von Infektionen mit resistenten oder gar multiresistenten Tuberkulosestämmen beobachtet. Multiresistenz ist auf mehrere erworbene Mutationen in unterschiedlichen Genen zurückzuführen. Obwohl der Tuberkuloseerreger bereits vor einem Jahrhundert entdeckt und beschrieben wurde, sind wir von einem vollständigen Verständnis der Infektion und der Virulenzmechanismen von M. tuberculosis weit entfernt. Nach einer Tröpfcheninfektion mit M. tuberculosis gelingt es dem Bakterium in den Makrophagen der Lungenalveolen zu überleben und teilweise für Jahrzehnte im Körper zu persistieren. Es wurde gezeigt, dass eine spezielle Klasse von Proteinen, die Lipoproteine; in verschiedenen Prozessen der Wirt-Pathogen Interaktionen beteiligt sind. Das Ziel dieser Studie ist 1) die Untersuchung des Transports von Lipoproteinen zur mykobakteriellen Zellwand sowie die Charakterisierung spezifischer Lipoproteine auf molekularer Ebene und 2) die Evaluation neuer antibiotischer Zielstrukturen und neuer Antibiotika sowie die Verstärkung der Wirkung bestehender Antibiotika.

Zur Untersuchung des Transports von Lipoproteinen zur Zellwand von Mykobakterien, wurden verschiedene Lipoproteine von M. tuberculosis in M. smegmatis, einem mykobakteriellen Modell-Organismus, exprimiert. Mit der Hilfe von subzellulären Fraktionierungstechniken konnten diese Reporterproteine entweder in der Cytoplas- mamembran oder in der Zellwand lokalisiert werden. Lipoproteine enthalten in ihrer maturen Form ein universell konserviertes und lipidiertes Cystein. In dem sehr gut untersuchten, Gram-negativen Bakterium Escherichia coli werden Lipoproteine durch das Lol-System zur äusseren Membran transportiert und verankert. Ein Rückhaltesignal, ein Asp an der Position +2 nach dem Cystein bewirkt, dass bestimmte Lipoproteine in der Plasmamembran verankert bleiben. Da Mykobakterien kein dem Lol-system entsprechendes Transportsystem besitzen, ist es wahrscheinlich, dass ihre Lipoproteine auch ein anderes Transportsignal besitzen. In SUMMARY 4

dieser Studie wurden durch gezielte Mutationen verschiedene artifizielle Reporterlipoproteine generiert, in M. smegmatis exprimiert und ihre Lokalisation mittels Fraktionierung untersucht. Die Resultate dieser Experimente zeigen, dass eine Region von 10 Aminosäuren unmittelbar C-terminal des Cysteins der Lipobox als ein positives Transportsignal dient.

Die aktuelle Standardtherapie zur Behandlung der Tuberkulose besteht aus einer Kombination mehrerer Antibiotika der ersten Wahl. Mit dem gehäuften Auftreten mehrfach medikamentenresistenter Stämme von M. tuberculosis, rücken die Medikamente der zweiten Wahl immer mehr in den Fokus. Aufgrund ihrer zum Teil schwierigeren Verabreichungsmethode (Injektion) und ihren grösseren Nebenwirkungen gelten diese Medikamente als zweite Wahl. Eines dieser Antibiotika ist Ethionamid. Ethionamid wird als ein Vorläufer verabreicht und muss, um seinen antibakteriellen Effekt zu entfalten, im Bakterium aktiviert werden. Dieser Vorgang wird von dem mykobakteriellen Enzym EthA katalysiert, dessen Expression von seinem natürlichen Repressor EthR vermindert wird. Durch systematisches Screening einer Sammlung chemischer Substanzen wurde 2- Phenylethyl-butyrat (2-PEB) entdeckt, welches die Fähigkeit hat, EthR von dem ethA/ethR- Operon abzulösen. Die hier vorliegende Studie zeigt mittels Medikamenten- Suszeptibilitätstests, dass die Kombination von 2-PEB und ETH einen synergistischen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von Mykobakterien hat, sogar auf Stämme mit Antibiotikaresistenzen. Durch die Zugabe von 2-PEB konnte somit die minimale Hemmkonzentration gesenkt werden.

Der letzte Teil dieser Arbeit widmet sich neuen möglichen Antibiotika zur Behandlung der Tuberkulose. Es handelt sich hierbei um eine Klasse von NAD-Synthetase Inhibitoren. NAD+ ist ein Coenzym, welches an Redox-Reaktionen in allen lebenden Zellen beteiligt ist. Im Gegensatz zu den Menschen, welche einen Recyclingweg für NAD+ besitzen, ist die Synthese von NAD+ in Bakterien vollständig von einer funktionellen NAD-Synthetase abhängig. Substanzen, welche in einem biochemischen Test die M. tuberculosis-NAD- Synthetase inhibierten, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, das Wachstum von M. tuberculosis zu hemmen. Eine der getesteten Substanzen zeigt eine vielversprechende Wirkung gegen M. tuberculosis. Diese neue Klasse von Antibiotika gibt Anlass zur Hoffnung im Kampf gegen die Tuberkulose.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Böttger Erik C, Sander Peter,
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:22 Feb 2011 15:23
Last Modified:24 Sep 2019 17:27
Number of Pages:154
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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