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Study of aminoglycoside antibiotics interaction with eukaryotic ribosomal decoding sites using bacterial hybrid ribosomes


Kalapala, Sarath Kumar. Study of aminoglycoside antibiotics interaction with eukaryotic ribosomal decoding sites using bacterial hybrid ribosomes. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

I

I. Summary

Anti-infective agents targeting the bacterial translation machinery must differentiate between prokaryotic and eukaryotic ribosomes. This discrimination provides the basis for the selectivity and toxicity of ribosomal drugs. Despite the use of ribosomal drugs for decades, we still do only in part understand the principles governing selectivity and toxicity of these agents. Most antibiotics that bind to the ribosome have been shown to interact directly with the ribosomal RNA (rRNA). rRNA is involved in all essential steps of translation e.g. selection of cognate aminoacyl-tRNA, peptide bond formation. The site of codon-anticodon interaction is located in the small ribosomal subunit and termed “decoding region” or A (aminoacyl)-site. It is mainly composed of small-subunit rRNA, i.e., helix 44 of bacterial 16S rRNA. The decoding region is also the binding site for the 2-deoxystreptamine aminoglycosides. Recent advances in X-ray crystallography have greatly contributed to the understanding of the structural interactions between aminoglycosides and the ribosomal decoding A-site. Aminoglycosides are polycationic amino sugars which are composed of a common core, termed neamine, in which a glycopyranosyl ring (ring I) is attached to position 4 of a 2-deoxystreptamine ring (ring II). Toxicity of 2-deoxystreptamines, i.e., ototoxicity and nephrotoxicity, limits their clinical use. The toxicity of aminoglycosides has been attributed in part to inhibition of mitochondrial protein synthesis. A single nucleotide polymorphism between bacterial 16S rRNA and its eukaryotic cytoplasmic counterpart, i.e., corresponding 16S rRNA position 1408A versus G (an adenine is found in prokaryotic ribosomes versus a guanine in eukaryotic cytoribosomes), has been suggested to form the basis for the selectivity of aminoglycoside antibiotics. The mitochondrial rRNA carries a susceptible adenine at the corresponding position providing a molecular explanation for the toxicity of these drugs. Toxicity of aminoglycosides seems also to be associated with genetic alterations of the human mitochondrial rRNA. Investigation of rRNA structure-function relationships in most organisms is complicated by the presence of a multitude of chromosomal rrn genes encoding rRNA. The multiplicity of genes encoding cytoplasmic and mitochondrial rRNA in higher eukaryotes does not allow for genetic manipulation of genes encoding ribosomal nucleic acids. Likewise, most bacterial species carry multiple rrn operons in the chromosome. The presence of several operons hampers the isolation of rrn mutants due to a recessive phenotype. In addition, a mixture of wild-type and mutated ribosomes complicates biochemical investigations. These limitations in investigating structure- function relationships of bacterial ribosomal nucleic acids at a genetic level were in part met by generating Mycobacterium smegmatis ΔrrnB, the first eubacterial organism carrying a single functional rrn operon which is amenable to genetic manipulations. Mutant ribosomal RNA operons were introduced into M. smegmatis ΔrrnB resulting in bacterial/eukaryotic hybrid ribosomes. II

1) Hybrid ribosomes carrying the rRNA decoding A-site of higher eukaryotic cytoribosomes show pronounced resistance to aminoglycoside antibiotics, equivalent to that of rabbit reticulocyte ribosomes. This finding suggests that helix 44 of the rRNA decoding A-site behaves as an autonomous domain, which can be exchanged between ribosomes of different phylogenetic domains for study of function. 2) Compared to hybrid ribosomes with the A-site of human cytosolic ribosomes, aminoglycoside susceptibility of hybrid ribosomes with the A-site of human mitochondrial ribosomes was found to be variable and to correlate with the relative cochleotoxicity of these drugs. This result provides experimental support for aminoglycoside-induced dysfunction of mitochondrial protein synthesis. 3) Recent reports on an interplay of S12 on 16S rRNA function and susceptibility to 2- deoxystreptamine aminoglycosides prompted us to study the role, if any, between rpsL K42R and alterations in 16S-rRNA helix 44 in more detail. We find that the non-restrictive rpsL K42R mutation does not affect the 2-deoxystreptamine susceptibility of various rRNA mutations in H44. The data presented in this thesis demonstrate that the model system developed properly reflects the situation in eukaryotic ribosomes and is useful to study the interaction of aminoglycoside antibiotics with eukaryotic ribosomes. With this, we can identify residues critical for the selectivity of aminoglycosides. Ultimately, a detailed understanding of the structure-function relationships will lead to the improvement of existing antimicrobials and the rational design of effective novel compounds. III

II. Antiinfektiöse Substanzen, welche an der bakteriellen Translationsmaschinerie angreifen, müssen zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Ribosomen unterscheiden. Eine solche Unterscheidung ist die Grundlage für die Selektivität und Toxizität von Antibiotika. Obwohl derartige Antibiotika seit Jahrzehnten eingesetzt werden, sind die Prinzipien, welche Selektivität und Toxizität dieser Substanzen bestimmen, noch immer nur teilweise verstanden. Für die meisten Antibiotika, die am Ribosom angreifen, wurde gezeigt, dass sie direkt mit der ribosomalen RNA (rRNA) interagieren. Die rRNA ist an allen wesentlichen Schritten der Translation beteiligt, z. B. an der Auswahl passender Aminoacyl-tRNA und der Bildung von Peptidbindungen. Der Ort der Codon-Anticodon-Wechselwirkung befindet sich in der kleinen ribosomalen Untereinheit und wird als „Decodierungsregion“ oder A-Stelle (Aminoacylstelle) bezeichnet. Er besteht hauptsächlich aus rRNA der kleinen Untereinheit, d. h. Helix 44 der bakteriellen 16S-rRNA. Die Decodierungsregion ist auch die Bindestelle für 2-Desoxystreptamin- Aminoglykoside. Aminoglykoside sind polykationische Aminozucker, die aus einem gemeinsamen Grundgerüst, dem Neamin, bestehen, in dem ein Glycopyranosylring (Ring I) an Position 4 eines 2- Desoxystreptaminrings (Ring II) gebunden ist. Die Toxizität von 2-Desoxystreptaminen, - und hier besonders die Ototoxizität -, schränkt ihre klinische Anwendung stark ein. Die Toxizität von Aminoglykosiden wird zum Teil auf eine Hemmung der mitochondrialen Proteinsynthese zurückgeführt. Hierbei wird postuliert, dass ein einzelner Nukleotidpolymorphismus zwischen der bakteriellen 16S-rRNA und ihrem eukaryontischen zytoplasmatischen Pendant an Position 1408 (ein Adenin findet man in prokaryontischen Ribosomen, ein Guanin dagegen in eukaryontischen Zytoribosomen) für die Selektivität von Aminoglykosidantibiotika verantwortlich ist. Demgegenüber enthält die mitochondriale rRNA an der entsprechenden Position ein Adenin, was eine mögliche molekulare Erklärung für die Toxizität dieser Arzneimittel liefert. Darüber hinaus scheint ein Zusammenhang zwischen der Toxizität von Aminoglykosiden und gewissen genetischen Veränderungen der humanen mitochondrialen rRNA zu bestehen. Die Vielzahl von Genen, welche für zytoplasmatische und mitochondriale rRNA in höheren Eukaryonten kodieren, macht ihre genetische Manipulation praktisch unmöglich. Auch die meisten Bakterienarten tragen mehrere rrn-Operons auf dem Chromosom. Die Gegenwart mehrerer Operons erschwert die Isolation von rrn-Mutanten aufgrund eines rezessiven Phänotyps. Darüber hinaus erschwert eine Mischung aus Wildtyp- und mutierten Ribosomen biochemische Untersuchungen. Diese Einschränkungen bei der Untersuchung von Struktur- Funktionsbeziehungen von bakteriellen ribosomalen Nukleinsäuren auf genetischer Ebene werden durch Mycobacterium smegmatis ΔrrnB umgangen. M. smegmatis ΔrrnB ist der erste eubakterielle Organismus, der ein einziges funktionelles rrn-Operon trägt, das für genetische Manipulationen zugänglich ist. IV

1) Hybridribosomen, welche die rRNA-Decodierungsstelle (A-Stelle) der Zytoribosomen höherer Eukaryonten aufweisen, zeigen eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Aminoglykosidantibiotika – gleichwertig mit der von Ribosomen aus Kaninchenretikulozyten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Helix 44 der rRNA-Decodierungsstelle (A-Stelle) sich als eine autonome Domäne verhält, die zur Funktionsanalyse zwischen Ribosomen verschiedenen phylogenetischen Ursprungs ausgetauscht werden kann. 2) Im Vergleich zu Hybridribosomen mit der A-Stelle humaner zytosolischer Ribosomen zeigen Hybridribosomen mit der A-Stelle humaner mitochondrialer Ribosomen unterschiedliche Aminoglykosid-Empfindlichkeit, welche mit der relativen Cochleotoxizität dieser Substanzen korreliert. Dieses Ergebnis liefert experimentelle Hinweise auf eine Aminoglykosid-induzierte Fehlfunktion der mitochondrialen Proteinsynthese. 3) Neuere Berichte über ein Zusammenspiel des ribosomalen Proteins S12 und der 16S-rRNA im Hinblick auf die Empfindlichkeit gegenüber 2-Desoxystreptamin-Aminoglykosiden veranlassten uns zu untersuchen, ob eine Funktionsbeziehung zwischen rpsL K42R und Veränderungen in der Helix 44 der 16S-rRNA besteht. Dabei konnten wir zeigen, dass die nichtrestriktive rpsL-K42R- Mutation die 2-Desoxystreptamin-Empfindlichkeit verschiedener rRNA-Mutationen in H44 nicht beeinflusst. Die in dieser Dissertation erbrachten Daten zeigen, dass das entwickelte Modellsystem die Situation in eukaryontischen Ribosomen korrekt widerspiegelt und zur Untersuchung der Wechselwirkung von Aminoglykosidantibiotika mit eukaryontischen Ribosomen geeignet ist. Auf diese Weise können für die Selektivität von Aminoglykosiden entscheidende Strukturen identifiziert werden. Letztlich ist ein genaues Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen entscheidend zur Verbesserung bestehender antimikrobieller Substanzen wie auch zur rationalen Entwicklung neuartiger Verbindungen.

Abstract

I

I. Summary

Anti-infective agents targeting the bacterial translation machinery must differentiate between prokaryotic and eukaryotic ribosomes. This discrimination provides the basis for the selectivity and toxicity of ribosomal drugs. Despite the use of ribosomal drugs for decades, we still do only in part understand the principles governing selectivity and toxicity of these agents. Most antibiotics that bind to the ribosome have been shown to interact directly with the ribosomal RNA (rRNA). rRNA is involved in all essential steps of translation e.g. selection of cognate aminoacyl-tRNA, peptide bond formation. The site of codon-anticodon interaction is located in the small ribosomal subunit and termed “decoding region” or A (aminoacyl)-site. It is mainly composed of small-subunit rRNA, i.e., helix 44 of bacterial 16S rRNA. The decoding region is also the binding site for the 2-deoxystreptamine aminoglycosides. Recent advances in X-ray crystallography have greatly contributed to the understanding of the structural interactions between aminoglycosides and the ribosomal decoding A-site. Aminoglycosides are polycationic amino sugars which are composed of a common core, termed neamine, in which a glycopyranosyl ring (ring I) is attached to position 4 of a 2-deoxystreptamine ring (ring II). Toxicity of 2-deoxystreptamines, i.e., ototoxicity and nephrotoxicity, limits their clinical use. The toxicity of aminoglycosides has been attributed in part to inhibition of mitochondrial protein synthesis. A single nucleotide polymorphism between bacterial 16S rRNA and its eukaryotic cytoplasmic counterpart, i.e., corresponding 16S rRNA position 1408A versus G (an adenine is found in prokaryotic ribosomes versus a guanine in eukaryotic cytoribosomes), has been suggested to form the basis for the selectivity of aminoglycoside antibiotics. The mitochondrial rRNA carries a susceptible adenine at the corresponding position providing a molecular explanation for the toxicity of these drugs. Toxicity of aminoglycosides seems also to be associated with genetic alterations of the human mitochondrial rRNA. Investigation of rRNA structure-function relationships in most organisms is complicated by the presence of a multitude of chromosomal rrn genes encoding rRNA. The multiplicity of genes encoding cytoplasmic and mitochondrial rRNA in higher eukaryotes does not allow for genetic manipulation of genes encoding ribosomal nucleic acids. Likewise, most bacterial species carry multiple rrn operons in the chromosome. The presence of several operons hampers the isolation of rrn mutants due to a recessive phenotype. In addition, a mixture of wild-type and mutated ribosomes complicates biochemical investigations. These limitations in investigating structure- function relationships of bacterial ribosomal nucleic acids at a genetic level were in part met by generating Mycobacterium smegmatis ΔrrnB, the first eubacterial organism carrying a single functional rrn operon which is amenable to genetic manipulations. Mutant ribosomal RNA operons were introduced into M. smegmatis ΔrrnB resulting in bacterial/eukaryotic hybrid ribosomes. II

1) Hybrid ribosomes carrying the rRNA decoding A-site of higher eukaryotic cytoribosomes show pronounced resistance to aminoglycoside antibiotics, equivalent to that of rabbit reticulocyte ribosomes. This finding suggests that helix 44 of the rRNA decoding A-site behaves as an autonomous domain, which can be exchanged between ribosomes of different phylogenetic domains for study of function. 2) Compared to hybrid ribosomes with the A-site of human cytosolic ribosomes, aminoglycoside susceptibility of hybrid ribosomes with the A-site of human mitochondrial ribosomes was found to be variable and to correlate with the relative cochleotoxicity of these drugs. This result provides experimental support for aminoglycoside-induced dysfunction of mitochondrial protein synthesis. 3) Recent reports on an interplay of S12 on 16S rRNA function and susceptibility to 2- deoxystreptamine aminoglycosides prompted us to study the role, if any, between rpsL K42R and alterations in 16S-rRNA helix 44 in more detail. We find that the non-restrictive rpsL K42R mutation does not affect the 2-deoxystreptamine susceptibility of various rRNA mutations in H44. The data presented in this thesis demonstrate that the model system developed properly reflects the situation in eukaryotic ribosomes and is useful to study the interaction of aminoglycoside antibiotics with eukaryotic ribosomes. With this, we can identify residues critical for the selectivity of aminoglycosides. Ultimately, a detailed understanding of the structure-function relationships will lead to the improvement of existing antimicrobials and the rational design of effective novel compounds. III

II. Antiinfektiöse Substanzen, welche an der bakteriellen Translationsmaschinerie angreifen, müssen zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Ribosomen unterscheiden. Eine solche Unterscheidung ist die Grundlage für die Selektivität und Toxizität von Antibiotika. Obwohl derartige Antibiotika seit Jahrzehnten eingesetzt werden, sind die Prinzipien, welche Selektivität und Toxizität dieser Substanzen bestimmen, noch immer nur teilweise verstanden. Für die meisten Antibiotika, die am Ribosom angreifen, wurde gezeigt, dass sie direkt mit der ribosomalen RNA (rRNA) interagieren. Die rRNA ist an allen wesentlichen Schritten der Translation beteiligt, z. B. an der Auswahl passender Aminoacyl-tRNA und der Bildung von Peptidbindungen. Der Ort der Codon-Anticodon-Wechselwirkung befindet sich in der kleinen ribosomalen Untereinheit und wird als „Decodierungsregion“ oder A-Stelle (Aminoacylstelle) bezeichnet. Er besteht hauptsächlich aus rRNA der kleinen Untereinheit, d. h. Helix 44 der bakteriellen 16S-rRNA. Die Decodierungsregion ist auch die Bindestelle für 2-Desoxystreptamin- Aminoglykoside. Aminoglykoside sind polykationische Aminozucker, die aus einem gemeinsamen Grundgerüst, dem Neamin, bestehen, in dem ein Glycopyranosylring (Ring I) an Position 4 eines 2- Desoxystreptaminrings (Ring II) gebunden ist. Die Toxizität von 2-Desoxystreptaminen, - und hier besonders die Ototoxizität -, schränkt ihre klinische Anwendung stark ein. Die Toxizität von Aminoglykosiden wird zum Teil auf eine Hemmung der mitochondrialen Proteinsynthese zurückgeführt. Hierbei wird postuliert, dass ein einzelner Nukleotidpolymorphismus zwischen der bakteriellen 16S-rRNA und ihrem eukaryontischen zytoplasmatischen Pendant an Position 1408 (ein Adenin findet man in prokaryontischen Ribosomen, ein Guanin dagegen in eukaryontischen Zytoribosomen) für die Selektivität von Aminoglykosidantibiotika verantwortlich ist. Demgegenüber enthält die mitochondriale rRNA an der entsprechenden Position ein Adenin, was eine mögliche molekulare Erklärung für die Toxizität dieser Arzneimittel liefert. Darüber hinaus scheint ein Zusammenhang zwischen der Toxizität von Aminoglykosiden und gewissen genetischen Veränderungen der humanen mitochondrialen rRNA zu bestehen. Die Vielzahl von Genen, welche für zytoplasmatische und mitochondriale rRNA in höheren Eukaryonten kodieren, macht ihre genetische Manipulation praktisch unmöglich. Auch die meisten Bakterienarten tragen mehrere rrn-Operons auf dem Chromosom. Die Gegenwart mehrerer Operons erschwert die Isolation von rrn-Mutanten aufgrund eines rezessiven Phänotyps. Darüber hinaus erschwert eine Mischung aus Wildtyp- und mutierten Ribosomen biochemische Untersuchungen. Diese Einschränkungen bei der Untersuchung von Struktur- Funktionsbeziehungen von bakteriellen ribosomalen Nukleinsäuren auf genetischer Ebene werden durch Mycobacterium smegmatis ΔrrnB umgangen. M. smegmatis ΔrrnB ist der erste eubakterielle Organismus, der ein einziges funktionelles rrn-Operon trägt, das für genetische Manipulationen zugänglich ist. IV

1) Hybridribosomen, welche die rRNA-Decodierungsstelle (A-Stelle) der Zytoribosomen höherer Eukaryonten aufweisen, zeigen eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Aminoglykosidantibiotika – gleichwertig mit der von Ribosomen aus Kaninchenretikulozyten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Helix 44 der rRNA-Decodierungsstelle (A-Stelle) sich als eine autonome Domäne verhält, die zur Funktionsanalyse zwischen Ribosomen verschiedenen phylogenetischen Ursprungs ausgetauscht werden kann. 2) Im Vergleich zu Hybridribosomen mit der A-Stelle humaner zytosolischer Ribosomen zeigen Hybridribosomen mit der A-Stelle humaner mitochondrialer Ribosomen unterschiedliche Aminoglykosid-Empfindlichkeit, welche mit der relativen Cochleotoxizität dieser Substanzen korreliert. Dieses Ergebnis liefert experimentelle Hinweise auf eine Aminoglykosid-induzierte Fehlfunktion der mitochondrialen Proteinsynthese. 3) Neuere Berichte über ein Zusammenspiel des ribosomalen Proteins S12 und der 16S-rRNA im Hinblick auf die Empfindlichkeit gegenüber 2-Desoxystreptamin-Aminoglykosiden veranlassten uns zu untersuchen, ob eine Funktionsbeziehung zwischen rpsL K42R und Veränderungen in der Helix 44 der 16S-rRNA besteht. Dabei konnten wir zeigen, dass die nichtrestriktive rpsL-K42R- Mutation die 2-Desoxystreptamin-Empfindlichkeit verschiedener rRNA-Mutationen in H44 nicht beeinflusst. Die in dieser Dissertation erbrachten Daten zeigen, dass das entwickelte Modellsystem die Situation in eukaryontischen Ribosomen korrekt widerspiegelt und zur Untersuchung der Wechselwirkung von Aminoglykosidantibiotika mit eukaryontischen Ribosomen geeignet ist. Auf diese Weise können für die Selektivität von Aminoglykosiden entscheidende Strukturen identifiziert werden. Letztlich ist ein genaues Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen entscheidend zur Verbesserung bestehender antimikrobieller Substanzen wie auch zur rationalen Entwicklung neuartiger Verbindungen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Böttger Erik C, Eberl Leo,
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:22 Feb 2011 15:18
Last Modified:24 Sep 2019 17:27
Number of Pages:57
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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