Abstract
Ribosomes are gigantic ribonucleoprotein particles that catalyze the polymerization of amino acids. There is a wealth of genetic and biochemical evidence to support the concept that the rRNA plays a pivotal role in ribosome functions, e.g. mRNA decoding, tRNA binding, peptidyl transfer, subunit association. The ribosome is target for a plethora of antibacterial agents including aminoglycosides, macrolides, ketolides, oxazolidinones, lincosamides. These compounds target different ribosomal functions like peptidyl transfer, mRNA decoding, tRNA translocation. Ribosomal antibiotics mainly bind to the rRNA which typically shows a high degree of phylogenetic sequence conservation within the drug-binding pocket. It is unclear whether the minor sequence variations present in the bacterial drug-binding site affect antibiotic susceptibility and/or resistance development. Previously, limitations in genetic manipulation did not allow to study the effect of rRNA sequence variations on bacterial drug susceptibility in isogenic mutants. Rather, investigations were limited to different bacterial species representative of the corresponding sequence variation. Phylogenetic differences in rRNA provide the basis for selectivity of compounds affecting the ribosome. However, sequence polymorphisms in the mitochondrial small subunit rRNA, namely A1555G and less frequently C1494U, have been identified as primary genetic traits in non- syndromic deafness. Both mutations locate to the A-site of mitochondrial 12S rRNA, a region essential for mRNA decoding. In addition to congenital deafness, the A1555G and C1494U mutations render affected individuals highly susceptible to aminoglycoside induced deafness. The high copy number of mitochondrial DNA in mitochondria and the vast number of mitochondria in a single cell have frustrated any attempt of genetic manipulation of mitochondrial rRNA in lower and higher eukaryotes. The absence of experimental models for diseases associated with mitochondrial rRNA polymorphisms has not only hampered insight into disease pathogenesis but also prevented the rational search for therapeutic interventions. In the thesis presented here, a derivative of the gram-positive Mycobacterium smegmatis rendered single rRNA operon allelic by gene-inactivation techniques was used for the experimental studies. Site-directed mutagenesis of the single chromosomal rRNA operon resulted in cells carrying homogenous populations of mutant ribosomes. Bacterial sequence polymorphisms were introduced representing the different bacterial clades. In addition, nucleotides in 16S rRNA helix 44 of M. smegmatis were replaced with those of wild-type and disease-associated mitochondrial versions resulting in hybrid ribosomes with a fully functional eukaryotic rRNA decoding site. 1) The natural sequence variations in the ribosomal peptidyl transfer center of bacteria were found not to affect drug susceptibility, but to impact the resistance phenotype of the A2058G mutation, in particular to the ketolide telithromycin. In contrast, natural sequence variations in the ribosomal A-site of bacteria affected both drug susceptibility and the resistance phenotype of the A1408G mutation.
2) The disease-associated sequence polymorphisms in mitochondrial rRNA, i.e. A1555G and C1494U, significantly reduced the accuracy of translation. Modelling the mitochondrial decoding site on available bacterial X-ray structures allowed to develop a structure-function hypothesis addressing the molecular mechanism of mutation-mediated misreading. 3) Mitochondrial rRNA sequence polymorphisms A1555G and C1494U significantly increased drug binding and ribosomal susceptibility to aminoglycoside-induced inhibition of protein synthesis and aminoglycoside-induced mistranslation. The results presented in this thesis indicate that misreading of the genetic code is an important molecular mechanism in both mitochondrial rRNA polymorphism-associated deafness and in aminoglycoside-induced ototoxicity. Our data establish the hybrid ribosome approach as an excellent model to study the mechanisms of mutation- and aminoglycoside- mediated dysfunction of the mitochondrial ribosome and to address issues of species-specific drug action in bacteria.
Ribosomen sind riesige Ribonukleoproteinkomplexe, welche die Polymerisation von Aminosäuren katalysieren. Eine Fülle genetischer und biochemischer Untersuchungen weisen darauf hin, dass die rRNA eine entscheidende Rolle bei der Funktion des Ribosoms wie z. B. mRNA-Decodierung, tRNA-Bindung, Peptidyltransfer und Assoziation der Untereinheiten einnimmt. Das Ribosom ist das Angriffsziel für eine Vielzahl von Antibiotika, darunter Aminoglykoside, Makrolide, Ketolide, Oxazolidinone und Lincosamide. Diese Verbindungen greifen in verschiedene ribosomale Funktionen wie Peptidyltransfer, mRNA-Decodierung oder tRNA-Translokation ein. Ribosomale Antibiotika binden hauptsächlich an die rRNA, die innerhalb der jeweiligen Bindungstasche einen hohen Grad an phylogenetischer Sequenzkonservierung aufweist. Es ist unklar, ob die geringen Sequenzvariationen, die in der bakteriellen Wirkstoffbindestelle vorhanden sind, die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bzw. die Entwicklung von Resistenzen beeinflussen. Bisher stiess man bei genetischen Manipulationen an methodische Grenzen, die es nicht erlaubten den Einfluss bakterieller rRNA-Sequenzvariationen auf die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika in isogenen Mutanten zu analysieren. Untersuchungen waren stattdessen auf verschiedene Bakterienarten begrenzt, die jeweils repräsentativ für die entsprechenden Sequenzvariationen sind. Phylogenetische Unterschiede in der rRNA bilden die Grundlage für die Selektivität von Antibiotika, die am Ribosom angreifen. Sequenzpolymorphismen in der rRNA der mitochondrialen kleinen Untereinheit, i.e. A1555G und seltener C1494U, wurden als primäre genetische Merkmale nicht-syndromischer Taubheit identifiziert. Beide Mutationen befinden sich in der A-Stelle der mitochondrialen 12S-rRNA, einer zur mRNA-Decodierung notwendigen Region. Zusätzlich zur angeborenen Taubheitsdisposition zeigen die A1555G- und C1494U-Mutationen bei betroffenen Personen eine hohe Anfälligkeit für Aminoglykosid-induzierte Taubheit. Die Multiplizität mitochondrialer DNA-Kopien in Mitochondrien sowie die enorme Anzahl an Mitochondrien in einer einzigen Zelle haben jegliche Versuche zur genetischen Manipulation von mitochondrialer rRNA in niederen und höheren Eukaryonten vereitelt. Der Mangel an experimentellen Modellen für Krankheiten, die mit mitochondrialen rRNA-Polymorphismen assoziiert sind, hat nicht nur den Einblick in die Pathogenese dieser Erkrankungen erschwert, sondern auch die rationale Suche nach therapeutischen Interventionen behindert. In der vorliegenden Dissertation wurde für die experimentellen Untersuchungen ein Stamm des grampositiven Bakteriums Mycobacterium smegmatis verwendet, bei dem durch Geninaktivierungstechniken nur ein einzelnes rRNA-Operon exprimiert wird. Punktgenaue Mutagenese des einzelnen chromosomalen rRNA-Operons führte zu Zellen, die eine homogene Population mutierter Ribosomen aufweisen. Es wurden bakterielle Sequenzvariationen eingeführt, welche die verschiedenen Bakteriengruppen repräsentieren. Darüber hinaus wurden Nukleotide in Helix 44 der 16S-rRNA von M. smegmatis mit jenen von wildtyp- und krankheitsassoziierten mitochondrialen Varianten ersetzt, woraus hybride Ribosomen mit einer vollständig funktionsfähigen eukaryontischen rRNA-Decodierungsstelle resultierten. 1) Es stellte sich heraus, dass die natürlichen Sequenzvariationen im ribosomalen Peptidyltransferasezentrum von Bakterien keine Auswirkung auf die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika haben, aber den Resistenzphänotyp der A2058G-Mutation, insbesondere gegenüber dem Ketolid Telithromycin, beeinflussen. Dagegen wirkten sich natürliche Sequenzvariationen in der ribosomalen A-Stelle von Bakterien sowohl auf die Empfindlichkeit gegenüber Aminoglycosiden als auch auf den Resistenzphänotyp der A1408G-Mutation aus. 2) Die krankheitsassoziierten Sequenzpolymorphismen mitochondrialer rRNA, d. h. A1555G und C1494U, führten zu einer signifikanten Reduktion der Translationsgenauigkeit. Die Modellierung der mitochondrialen Decodierungsstelle anhand vorliegender bakterieller Röntgenstrukturen ermöglichten die Entwicklung einer Struktur-Funktionshypothese, die den molekularen Mechanismus von mutationsvermittelten Lesefehlern beschreibt. 3) Die Sequenzpolymorphismen A1555G und C1494U in mitochondrialer rRNA führten zu einer signifikanten Zunahme der Bindung von Aminoglycosid-Antibiotika. Sie erhöhen die ribosomale Empfindlichkeit gegenüber Aminoglykosid-induzierter Hemmung der Proteinsynthese und Aminoglykosid-induzierten Translationsfehlern. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fehler beim Ablesen des genetischen Codes einen wichtigen Mechanismus sowohl bei Taubheit, welche mit Polymorphismen in mitochondrialer rRNA assoziiert ist, als auch bei Aminoglykosid-induzierter Ototoxizität darstellt. Unsere Daten etablieren den Hybridribosomenansatz als ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse Mutations- und Aminoglykosid-vermittelter Fehlfunktion des mitochondrialen Ribosoms und zur Untersuchung von Aspekten artspezifischer Antibiotikaempfindlichkeit in Bakterien.
Subramanian, Akshay