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New insights into the pathogenesis of the Mycoplasma suis infection


Gröbel, Katrin. New insights into the pathogenesis of the Mycoplasma suis infection. 2010, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Mycoplasma (M.) suis is a member of the haemotrophic mycoplasmas (HM), a group of cell wall-less bacteria known to parasitize on the surface of the red blood cells (RBCs) of a wide variety of vertebrate animals. M. suis is strongly adapted to the swine and causes infectious anaemia in pigs (IAP), an infectious disease mainly occurring in weaned and feeder pigs that are immunosuppressed. The acute form of the disease is characterised by a febrile anaemia, icterus and cyanosis at the acrae. Chronic infections are mainly asymptomatic, can however be accompanied by growth retardation, reduced reproduction rate of sows and a higher susceptibility to other diseases.
Basic research on HM is complicated due to the impossibility to cultivate these organisms. In this study high-resolution microscopic techniques were applied on blood and tissue of M. suis infected pigs in order to study the host-pathogen interaction in more detail and examine the dissemination of M. suis within the host.
In temporal connection with research activities on the M. suis infection, an increased incidence of acute IAP in feeder pigs was observed with predominantly fatal outcome despite antibiotic therapy. Contrary to the expected high numbers of M. suis cells on and between the erythrocytes in acridine orange-stained blood smears - the established diagnostic feature of acute IAP - only marginal numbers of the bacterial cells were noticed. This microscopic finding completely conflicted with the results of quantitative real-time PCR that detected high numbers of M. suis (109 to 1010 cells per ml blood) in the same blood samples. This striking difference between microscopy and PCR raised the issue of an intracellular localisation of M. suis within the erythrocytes. In this thesis verification of this hypothesis was carried out work by means of experimental infection of splenectomised pigs with the highly virulent M. suis strain 08/07 and microscopic analysis of infected RBCs using scanning (SEM) - and transmission electron microscopy (TEM) as well as confocal laser scanning microscopy. We concluded that the organism invades the erythrocytes in an endocytosis-like process and is initially surrounded by the host cell membrane. M. suis could also be found floating freely in the cytoplasm. In this study it was shown for the first time that a member of the haemoplasma group is able to invade the erythrocytes of its host.
Several authors have reported about haemorrhagic diathesis in pigs with acute IAP as well as about intravascular coagulation and subsequent consumption of platelets indicating vascular damages during the M. suis infection. Further observations confirming the assumption of vascular injury during IAP is the massive change in erythrocyte morphology, RBC aggregation and subsequent development of cyanoses in areas with less blood circulation (ear, tail).
Using SEM and TEM a massive endothelial injury was detected on the luminal side of the vessel walls of acutely diseased M. suis infected pigs. Damages were associated with endothelial alterations as well as denudation of endothelial cells, which could be confirmed by histochemical analysis. Erythrocytes were found to be attached to the vascular wall – either alone or together with leucocytes and platelets embedded in a network of fibrin fibres, forming arterial thrombi. In addition, bacterial biofilms were observed on the luminal side of the blood vessels. Infrequently, single M. suis cells were found being attached to the endothelium. Applying TEM and histochemical staining intravascular coagulation could be detected in capillaries of parenchymas such as kidney, lung, and liver.
Endothelial cell death is often associated with an increased TNF- concentration in the blood. However, no elevated serum concentrations of porcine TNF- could be detected in acutely diseased pigs. Therefore, endothelial apoptosis is probably triggered by other serum factors or by attachment or invasion of M. suis to the endothelial cells itself.
In in vitro studies with porcine aortic endothelial cells (PAECs) and M. suis containing plasma of diseased pigs attachment of M. suis to PAECs could be confirmed. At the point of attachment an aggregation of the host cell actin was observed. In addition, PAECs incubated with porcine plasma and sera from acutely diseased M. suis infected pigs had a higher apoptosis rate than PAECs incubated with control plasma and sera.
In conclusion, the results of this thesis, specifically the intraerythrocytary localisation of M. suis in combination with the formation of biofilms on the vascular endothelium, help to explain the long-life persistence of this bacteria (and other HM). Biofilm formation, as well as intracellular localisation, generally protects bacteria from the host immune system and from killing by antibiotics. Therefore, this study serves as the basis for novel strategies in the HM research, e.g. treatment or prophylaxis.


Mycoplasma (M.) suis ist ein Vertreter der hämotrophen Mycoplasmen (HM), einer Gruppe von zellwandlosen Bakterien, die auf der Oberfläche der roten Blutzellen einer Vielzahl von Säugetieren parasitieren. M. suis verursacht die infektiöse Anämie des Schweins (IAP), eine Infektionskrankheit welche hauptsächlich bei Absatzferkeln und Mastschweinen vorkommt, wenn diese unter Belastung stehen. Die akute Form der Krankheit äussert sich in einer fieberhaften Anämie, Ikterus und Zyanosen an den Akren. Chronische Infektionen sind grösstenteils asymptomatisch, können aber von Wachstumsstagnationen, einer verminderten Fruchtbarkeit und einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen gekennzeichnet sein.
Die Erforschung der hämotrophen Mycoplasmen wird durch die Unkultivierbarkeit der Erreger erschwert. In dieser Dissertation wurden Blut- und Gewebeproben von mit M. suis infizierten Schweinen hochauflösenden mikroskopischen Techniken unterzogen, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und die Verbreitung des Erregers im Wirt zu untersuchen.
In zeitlichem Zusammenhang mit Forschungsarbeiten zu M. suis-Infektionen sind wir auf ein vermehrtes Auftreten akuter IAP in Mastschweinen aufmerksam geworden. Trotz antibiotischer Behandlung waren diese Erkrankungen vorwiegend tödlich. Im Gegensatz zu den erwarteten hohen Erregerzahlen in mit Acridine Orange gefärbten Blutausstrichen – einem üblichen diagnostischen Befund bei akuter IAP – konnten wir nur wenige Erreger nachweisen. Dieser mikroskopische Befund stand in starkem Widerspruch zu den Ergebnissen der quantitativen Real-Time PCR, mit der hohe Erregermengen (109-1010 Zellen pro ml Blut) in denselben Blutproben detektiert werden konnten. Dieser auffällige Unterschied zwischen Mikroskopie und PCR warf die Hypothese auf, dass es sich um ein neues M. suis Isolat handelt, welches in die Erythrozyten invadiert. In dieser Arbeit erfolgte die Bestätigung dieser Hypothese nach experimenteller Infektion splenektomierter Schweine mit dem hochvirulenten M. suis-Isolat 08/07 und anschließender mikroskopischer Untersuchung infizierter Erythrozyten im Transmissions- und Rasterelektronenmikroskop sowie im konfokalen Laserrastermikroskop. M. suis invadiert den Erythrozyten in einem endozytoseähnlichen Prozess und ist anfangs von der Wirtszellmembran umschlossen. Der Erreger wurde auch frei im Zytoplasma des Erythrozyten vorgefunden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Vertreter der HM in der Lage ist, in die Erythrozyten zu invadieren.
In verschiedenen Publikationen wird auf eine erhöhte hämorrhagische Diathese, intravaskuläre Koagulation und Thrombozytopenie in Schweinen mit akuter IAP hingewiesen, was auf vaskuläre Schäden während der M. suis-Infektion hinweist. Weitere Beobachtungen, welche diese Vermutung untermauern, sind die massiven Änderungen in der Erythrozytenmorphologie, die verstärkte Aggregation der roten Blutzellen und die Ausprägung von Zyanosen in Körperbereichen mit geringer Blutzirkulation (Ohr, Schwanz).
Mit Hilfe von raster- und transmissionselektronenmikroskopischen Verfahren konnte eine massive Veränderung des Endothels in Blutgefässen akut erkrankter M. suis-infizierter Schweine aufgezeigt werden. Die Schädigungen beinhalteten grossflächige Ablösung der Endothelzellen, sowie morphologische Veränderungen, welche in histologischen Untersuchungen bestätigt wurden. Wandhaftende Erythrozyten sowie arterielle Thromben, bestehend aus dichten Fibrinnetzwerken in welche Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten eingebettet sind, wurden vorgefunden. Weiterhin wurden bakterielle Biofilme auf der Endothelschicht beobachtet. Gelegentlich wurden auch einzelne M. suis Zellen auf der Innenseite der Gefässe detektiert. In transmissionselektronenmikroskopischen und histochemischen Untersuchungen wurden intravaskuläre Koagulationen in Kapillaren von grossen Parenchymen, wie der Niere, der Lunge und der Leber bestätigt.
Endothelialer Zelltod ist oft verbunden mit einer erhöhten TNF- Konzentration im Blut. Es konnte jedoch kein erhöhter TNF- Spiegel im Blutserum akut erkrankter Schweine nachgewiesen werden. Daher wird die Endothelzellapoptose wahrscheinlich durch andere Serumkomponenten oder auch durch die Adhäsion von M. suis an Endothelzellen selbst ausgelöst.
In in vitro Versuchen mit porzinen aortischen Endothelzellen (PAECs) und erregerhaltigem Plasma von M. suis-infizierten Schweinen konnten wir die Adhäsion von M. suis an Endothelzellen bestätigen. Ausserdem konnte eine Aggregation des Wirtzellaktins an den Kontaktstellen zu M. suis festgestellt werden. PAECs, welche mit Plasma und Seren akut infizierter Tiere inkubiert wurden, wiesen zudem eine höhere Apoptoserate auf als PAECs, welche mit Kontrollplasma und Seren inkubiert wurden.
Zusammenfassend dienen die Ergebnisse dieser Dissertation, insbesondere die intrazelluläre Lokalisation des Erregers sowie dessen Fähigkeit zur Biofilmbildung auf Endothelzellen, der Aufklärung der Persistenz von M. suis (und anderen HM). Bakterien innerhalb von Biofilmen oder Wirtszellen sind generell resistenter gegen die Immunantwort des Wirtes und geschützt vor einer Eliminierung durch Antibiotika. Daher kann diese Studie als Grundlage für neue Strategien zur Verbesserung der medikamentösen Behandlung und Prophylaxe von Hämoplasmeninfektionen dienen.

Abstract

Mycoplasma (M.) suis is a member of the haemotrophic mycoplasmas (HM), a group of cell wall-less bacteria known to parasitize on the surface of the red blood cells (RBCs) of a wide variety of vertebrate animals. M. suis is strongly adapted to the swine and causes infectious anaemia in pigs (IAP), an infectious disease mainly occurring in weaned and feeder pigs that are immunosuppressed. The acute form of the disease is characterised by a febrile anaemia, icterus and cyanosis at the acrae. Chronic infections are mainly asymptomatic, can however be accompanied by growth retardation, reduced reproduction rate of sows and a higher susceptibility to other diseases.
Basic research on HM is complicated due to the impossibility to cultivate these organisms. In this study high-resolution microscopic techniques were applied on blood and tissue of M. suis infected pigs in order to study the host-pathogen interaction in more detail and examine the dissemination of M. suis within the host.
In temporal connection with research activities on the M. suis infection, an increased incidence of acute IAP in feeder pigs was observed with predominantly fatal outcome despite antibiotic therapy. Contrary to the expected high numbers of M. suis cells on and between the erythrocytes in acridine orange-stained blood smears - the established diagnostic feature of acute IAP - only marginal numbers of the bacterial cells were noticed. This microscopic finding completely conflicted with the results of quantitative real-time PCR that detected high numbers of M. suis (109 to 1010 cells per ml blood) in the same blood samples. This striking difference between microscopy and PCR raised the issue of an intracellular localisation of M. suis within the erythrocytes. In this thesis verification of this hypothesis was carried out work by means of experimental infection of splenectomised pigs with the highly virulent M. suis strain 08/07 and microscopic analysis of infected RBCs using scanning (SEM) - and transmission electron microscopy (TEM) as well as confocal laser scanning microscopy. We concluded that the organism invades the erythrocytes in an endocytosis-like process and is initially surrounded by the host cell membrane. M. suis could also be found floating freely in the cytoplasm. In this study it was shown for the first time that a member of the haemoplasma group is able to invade the erythrocytes of its host.
Several authors have reported about haemorrhagic diathesis in pigs with acute IAP as well as about intravascular coagulation and subsequent consumption of platelets indicating vascular damages during the M. suis infection. Further observations confirming the assumption of vascular injury during IAP is the massive change in erythrocyte morphology, RBC aggregation and subsequent development of cyanoses in areas with less blood circulation (ear, tail).
Using SEM and TEM a massive endothelial injury was detected on the luminal side of the vessel walls of acutely diseased M. suis infected pigs. Damages were associated with endothelial alterations as well as denudation of endothelial cells, which could be confirmed by histochemical analysis. Erythrocytes were found to be attached to the vascular wall – either alone or together with leucocytes and platelets embedded in a network of fibrin fibres, forming arterial thrombi. In addition, bacterial biofilms were observed on the luminal side of the blood vessels. Infrequently, single M. suis cells were found being attached to the endothelium. Applying TEM and histochemical staining intravascular coagulation could be detected in capillaries of parenchymas such as kidney, lung, and liver.
Endothelial cell death is often associated with an increased TNF- concentration in the blood. However, no elevated serum concentrations of porcine TNF- could be detected in acutely diseased pigs. Therefore, endothelial apoptosis is probably triggered by other serum factors or by attachment or invasion of M. suis to the endothelial cells itself.
In in vitro studies with porcine aortic endothelial cells (PAECs) and M. suis containing plasma of diseased pigs attachment of M. suis to PAECs could be confirmed. At the point of attachment an aggregation of the host cell actin was observed. In addition, PAECs incubated with porcine plasma and sera from acutely diseased M. suis infected pigs had a higher apoptosis rate than PAECs incubated with control plasma and sera.
In conclusion, the results of this thesis, specifically the intraerythrocytary localisation of M. suis in combination with the formation of biofilms on the vascular endothelium, help to explain the long-life persistence of this bacteria (and other HM). Biofilm formation, as well as intracellular localisation, generally protects bacteria from the host immune system and from killing by antibiotics. Therefore, this study serves as the basis for novel strategies in the HM research, e.g. treatment or prophylaxis.


Mycoplasma (M.) suis ist ein Vertreter der hämotrophen Mycoplasmen (HM), einer Gruppe von zellwandlosen Bakterien, die auf der Oberfläche der roten Blutzellen einer Vielzahl von Säugetieren parasitieren. M. suis verursacht die infektiöse Anämie des Schweins (IAP), eine Infektionskrankheit welche hauptsächlich bei Absatzferkeln und Mastschweinen vorkommt, wenn diese unter Belastung stehen. Die akute Form der Krankheit äussert sich in einer fieberhaften Anämie, Ikterus und Zyanosen an den Akren. Chronische Infektionen sind grösstenteils asymptomatisch, können aber von Wachstumsstagnationen, einer verminderten Fruchtbarkeit und einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen gekennzeichnet sein.
Die Erforschung der hämotrophen Mycoplasmen wird durch die Unkultivierbarkeit der Erreger erschwert. In dieser Dissertation wurden Blut- und Gewebeproben von mit M. suis infizierten Schweinen hochauflösenden mikroskopischen Techniken unterzogen, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und die Verbreitung des Erregers im Wirt zu untersuchen.
In zeitlichem Zusammenhang mit Forschungsarbeiten zu M. suis-Infektionen sind wir auf ein vermehrtes Auftreten akuter IAP in Mastschweinen aufmerksam geworden. Trotz antibiotischer Behandlung waren diese Erkrankungen vorwiegend tödlich. Im Gegensatz zu den erwarteten hohen Erregerzahlen in mit Acridine Orange gefärbten Blutausstrichen – einem üblichen diagnostischen Befund bei akuter IAP – konnten wir nur wenige Erreger nachweisen. Dieser mikroskopische Befund stand in starkem Widerspruch zu den Ergebnissen der quantitativen Real-Time PCR, mit der hohe Erregermengen (109-1010 Zellen pro ml Blut) in denselben Blutproben detektiert werden konnten. Dieser auffällige Unterschied zwischen Mikroskopie und PCR warf die Hypothese auf, dass es sich um ein neues M. suis Isolat handelt, welches in die Erythrozyten invadiert. In dieser Arbeit erfolgte die Bestätigung dieser Hypothese nach experimenteller Infektion splenektomierter Schweine mit dem hochvirulenten M. suis-Isolat 08/07 und anschließender mikroskopischer Untersuchung infizierter Erythrozyten im Transmissions- und Rasterelektronenmikroskop sowie im konfokalen Laserrastermikroskop. M. suis invadiert den Erythrozyten in einem endozytoseähnlichen Prozess und ist anfangs von der Wirtszellmembran umschlossen. Der Erreger wurde auch frei im Zytoplasma des Erythrozyten vorgefunden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Vertreter der HM in der Lage ist, in die Erythrozyten zu invadieren.
In verschiedenen Publikationen wird auf eine erhöhte hämorrhagische Diathese, intravaskuläre Koagulation und Thrombozytopenie in Schweinen mit akuter IAP hingewiesen, was auf vaskuläre Schäden während der M. suis-Infektion hinweist. Weitere Beobachtungen, welche diese Vermutung untermauern, sind die massiven Änderungen in der Erythrozytenmorphologie, die verstärkte Aggregation der roten Blutzellen und die Ausprägung von Zyanosen in Körperbereichen mit geringer Blutzirkulation (Ohr, Schwanz).
Mit Hilfe von raster- und transmissionselektronenmikroskopischen Verfahren konnte eine massive Veränderung des Endothels in Blutgefässen akut erkrankter M. suis-infizierter Schweine aufgezeigt werden. Die Schädigungen beinhalteten grossflächige Ablösung der Endothelzellen, sowie morphologische Veränderungen, welche in histologischen Untersuchungen bestätigt wurden. Wandhaftende Erythrozyten sowie arterielle Thromben, bestehend aus dichten Fibrinnetzwerken in welche Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten eingebettet sind, wurden vorgefunden. Weiterhin wurden bakterielle Biofilme auf der Endothelschicht beobachtet. Gelegentlich wurden auch einzelne M. suis Zellen auf der Innenseite der Gefässe detektiert. In transmissionselektronenmikroskopischen und histochemischen Untersuchungen wurden intravaskuläre Koagulationen in Kapillaren von grossen Parenchymen, wie der Niere, der Lunge und der Leber bestätigt.
Endothelialer Zelltod ist oft verbunden mit einer erhöhten TNF- Konzentration im Blut. Es konnte jedoch kein erhöhter TNF- Spiegel im Blutserum akut erkrankter Schweine nachgewiesen werden. Daher wird die Endothelzellapoptose wahrscheinlich durch andere Serumkomponenten oder auch durch die Adhäsion von M. suis an Endothelzellen selbst ausgelöst.
In in vitro Versuchen mit porzinen aortischen Endothelzellen (PAECs) und erregerhaltigem Plasma von M. suis-infizierten Schweinen konnten wir die Adhäsion von M. suis an Endothelzellen bestätigen. Ausserdem konnte eine Aggregation des Wirtzellaktins an den Kontaktstellen zu M. suis festgestellt werden. PAECs, welche mit Plasma und Seren akut infizierter Tiere inkubiert wurden, wiesen zudem eine höhere Apoptoserate auf als PAECs, welche mit Kontrollplasma und Seren inkubiert wurden.
Zusammenfassend dienen die Ergebnisse dieser Dissertation, insbesondere die intrazelluläre Lokalisation des Erregers sowie dessen Fähigkeit zur Biofilmbildung auf Endothelzellen, der Aufklärung der Persistenz von M. suis (und anderen HM). Bakterien innerhalb von Biofilmen oder Wirtszellen sind generell resistenter gegen die Immunantwort des Wirtes und geschützt vor einer Eliminierung durch Antibiotika. Daher kann diese Studie als Grundlage für neue Strategien zur Verbesserung der medikamentösen Behandlung und Prophylaxe von Hämoplasmeninfektionen dienen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Eberl Leo, Hölzle Ludwig E, Pernthaler Jakob, Wittenbrink Max M
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Food Safety and Hygiene
07 Faculty of Science > Department of Plant and Microbial Biology
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:25 Feb 2011 14:17
Last Modified:15 Apr 2021 14:12
Number of Pages:88
Additional Information:Enthält einen Sonderdruck aus: Infection and immunity, Feb. 2009, S. 576-584
OA Status:Green

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