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Regulated function of oxygen sensing HIF prolyl-4-hydroxylases


Nytko, Katarzyna Józefa. Regulated function of oxygen sensing HIF prolyl-4-hydroxylases. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Zusammenfassung Eine genaue Rezeption des zellulären Sauerstoffgehalts durch Prolyl-4-Hydroxylase Domänen (PHD) enthaltende Sauerstoff-Sensorproteine ist für viele physiologische Prozesse im menschlichen Körper von grosser Bedeutung. Dieselben Signalwege spielen aber auch bei der Ausbildung von Krankheiten eine entscheidende Rolle. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) sind das vorrangige Hydroxylierungssubstrat für PHDs und fungieren als Sauerstoff- regulierte Transkriptionsfaktoren, indem sie die Expression von mehr als 100 Zielgenen kontrollieren. Die wichtigsten Beispiele für HIF-regulierte Genprodukte sind unter anderem das für die Neubildung von Erythrozyten verantwortliche Erythropoietin (EPO), aber auch pro-angiogene Wachstumsfaktoren wie VEGF und Proteine des zellulären Glukose- Stoffwechsels (z.B. GLUT1, PDK1). Die enzymatische Aktivität von PHDs ist unmittelbar an die Verfügbarkeit von Sauerstoff gekoppelt, aber auch andere Kofaktoren und Kosubstrate beeinflussen ihre spezifische Hydroxylierungskapazität. Die Nutzung eines Hydroxylierungsassays als rekonstituiertes System erlaubte uns, die Abhängigkeit aller drei PHD Isoformen von verschiedenen einfachen, potentiell inhibierenden oder aktivierenden Substanzen („small molecules“) zu untersuchen. Während die enzymatische Aktivität von PHDs in Gegenwart von Eisen(II), 2-Oxoglutarat und Ascorbat dosisabhängig gesteigert war, inhibierten Substanzen wie Succinat oder polyphenolische Antioxidantien die Hydroxylierungs-aktivität der PHDs. Übergangsmetalle wie Kobalt(II) und Zink(II), chelierende Agenzien (DFX, EDTA) und reaktive Sauerstoffspezies (Wasserstoffperoxid) waren weitere effiziente Hemmstoffe der PHDs. Mechanistisch funktionieren diese Substanzen zumindest teilweise durch die Abreicherung oder Inaktivierung eines oder mehrerer der für die Hydroxylierungs-reaktion notwendigen Kofaktoren. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, dass Kupfer(II), jedoch nicht Kobalt(II) oder Eisen(II), die Oxidation von Ascorbat zu Dehydroascorbat katalysieren kann, wobei letzteres keinen aktivierenden Einfluss mehr auf die PHDs ausübt. Eine Mangelversorgung mit Ascorbat (Vitamin C) verursacht die als Skorbut bekannte Systemerkrankung mit unzureichender Quervernetzung des Kollagens im Bindegewebe, der eine verminderte Aktivität der Kollagen- Prolyl-4-Hydroxylasen zugrunde liegt. Da PHDs zur gleichen Untergruppe von Enzymen wie Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylasen gehören, wurde in dieser Arbeit ein möglicher Einfluss von Ascorbat auf Mechanismen der Sauerstoff-Rezeption in vivo untersucht. Hierzu fand ein genetisch modifiziertes Tiermodell mit Mäusen Verwendung, die eine biallelische Inaktivierung des L-Gulonolacton Oxidasegens (Gulo) aufweisen, das für ein Schlüsselenzym zur körpereigenen Synthese von Ascorbat kodiert. Folglich sind diese Tiere abhängig von der Aufnahme von Ascorbat mit der Nahrung. Im Vergleich zu Tieren, die Ascorbat mit dem Trinkwasser erhielten, zeigten Gulo-/- Mäuse, denen fünf Wochen lang eine Ascorbat-freie Diät gefüttert wurde, keine wesentlichen Änderungen in der Expression von HIF Zielgenen. Ausserdem konnten keine merklichen Unterschiede zwischen beiden Behandlungsgruppen in der Expression von EPO mRNA in der Niere und zirkulierendem EPO Protein im Plasma nach einer 24-stündigen hypoxischen Episode mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von ca. 8% O2 festgestellt werden. Unsere Daten legen nahe, dass eine Ascorbat-Defizienz keinen Einfluss auf die systemische Adaptation an Sauerstoffmangelzustände hat und die Rolle von Ascorbat im Organismus durch andere Antioxidantien kompensiert werden kann. Diese Hypothese findet zusätzlich Unterstützung in der Beobachtung, dass humane Zervixkarzinom-Zellen, die unter vollständig Ascorbat-freien Kulturbedingungen gehalten wurden, eine identische hypoxische HIF-1α Stablilisierung und transkriptionelle HIF Aktivität zeigten wie Zellen, die in Gegenwart von 50 μM Ascorbat wuchsen. Glutathion (GSH) ist das weitaus verbreitetste Antioxidant in menschlichen Zellen, weswegen wir den Einfluss von GSH auf die enzymatische Aktivität von PHDs in vitro untersucht haben. Tatsächlich wurden alle drei PHD Isoformen in dosisabhängiger Weise durch GSH aktiviert. Analog zur Behandlung mit Ascorbat zeigten humane Hepatomazellen in Gegenwart von GSH einen reduzierten HIF-1α Proteingehalt, wie auch die transkriptionelle Aktivität von Kobalt(II)-induziertem HIF vermindert war. Desweiteren veringerte Glutathion die durch Fenton-Reaktion bzw. Kobalt(II)- und Wasserstoffperoxid-vermittelte Proteinoxidation von rekombinantem PHD2 Enzym, wie durch das Messen der Proteinkarbonylierung bestimmt wurde. Interessanterweise konnte die Mutation des Cysteinrestes an Position 201 des Proteins zu Serin die basale Hydroxylierungsaktivität von PHD2 erhöhen und steigerte die Resistenz des rekombinanten Proteins gegenüber oxidativen Noxen. Dieser strukturell zugängliche und konservierte Cysteinrest stellt daher einen möglichen Angriffspunkt zur antioxidativen Aktivierung von PHDs durch Vitamin C und Glutathion dar. Summary Oxygen sensing by prolyl-4-hydroxylases domain (PHD) proteins is involved in many physiological as well as pathophysiological processes in the human body. Hypoxia-inducible factors (HIFs) are the prime hydroxylation targets of PHDs and function as oxygen regulated transcription factors controlling the expression of more than 100 target genes. Genes involved in erythropoiesis (e.g. EPO), angiogenesis (e.g. VEGF) as well as glucose transport and metabolism (e.g. GLUT1, PDK1) are the most prominent examples of HIF-regulated genes. PHD activity is regulated primarily by the availability of oxygen but also other co-factors and co-substrates can affect their hydroxylation capacity. Using a reconstituted hydroxylation assay we attempted to investigate the dependency of all three PHDs isoforms on different types of small molecule activators and inhibitors. While addition of iron (II), 2-oxoglutarate and ascorbate was enhancing PHD activity in a dose-dependent manner, other compounds such as succinate or polyphenolic antioxidants were inhibiting hydroxylation activity of all three PHDs. Transition metals (cobalt (II), zinc (II)), metal chelators (DFX, EDTA) and reactive oxygen species (hydrogen peroxide) were efficient inhibitors of PHD activity. The mechanisms of action of these compounds could be explained at least partially by depletion of one of the co-factors necessary for the hydroxylation reaction. We could show that copper (II), but not cobalt (II) and iron (II) catalysed oxidation of ascorbate to dehydroascorbate, which is incapable to activate PHDs. Ascorbate deficiency is known to cause a systemic disorder called scurvy, resulting from insufficient hydroxylation of collagen by collagen prolyl-4-hydroxlases in connective tissues. PHDs belong to the same subclasses of enzymes as collagen prolyl-4-hydroxylases, therefore we attempted to investigate whether ascorbate deficiency can affect oxygen sensing mechanisms in vivo. We used a knock-out mouse model lacking the key enzyme involved in ascorbic acid synthesis, Gulono-1,4-lactone oxidase (Gulo) and as a consequence the animals depend on ascorbate supplementation in the diet. When Gulo-/- mice were kept for 5 weeks at an ascorbate-free diet, expression of HIF-target genes was unchanged if compared to control animals receiving ascorbate with the drinking water. Moreover, when Gulo-/- mice were exposed to inspiratory hypoxia (8% oxygen for 24 hours) after 5 weeks of ascorbate depletion, no significant changes to the ascorbate fed control group between Epo mRNA in the kidney and EPO plasma protein levels were observed. These data suggest, that ascorbate deficiency might be compensated by other antioxidants in vivo. In support with this notion, HeLa cells grown in the absence of ascorbate showed equal hypoxic stabilization of HIF-1α protein and HIF activity as cells supplemented with 50 μM ascorbate. The most abundant intracellular antioxidant in human cells is glutathione (GSH). Therefore we tested its influence on PHDs activity in vitro. All three PHDs were robustly activated by GSH in a dose-dependent manner. Similarly to ascorbate, GSH could reduced HIF1-α protein levels and HIF transcriptional activity in cobalt (II) treated hepatoma cells. Glutathione protected recombinant PHD2 enzyme from oxidation by Fenton reaction and cobalt (II) as measured by carbonylation of the PHD2 protein. Interestingly, a C201S mutation in PHD2 increased basal hydroxylation rates of the enzyme and conferred resistance to oxidative damage in vitro, suggesting that this structurally conserved and surface accessible cysteine residue could be a target of antioxidative protection of PHDs by vitamin C and glutathione.

Abstract

Zusammenfassung Eine genaue Rezeption des zellulären Sauerstoffgehalts durch Prolyl-4-Hydroxylase Domänen (PHD) enthaltende Sauerstoff-Sensorproteine ist für viele physiologische Prozesse im menschlichen Körper von grosser Bedeutung. Dieselben Signalwege spielen aber auch bei der Ausbildung von Krankheiten eine entscheidende Rolle. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) sind das vorrangige Hydroxylierungssubstrat für PHDs und fungieren als Sauerstoff- regulierte Transkriptionsfaktoren, indem sie die Expression von mehr als 100 Zielgenen kontrollieren. Die wichtigsten Beispiele für HIF-regulierte Genprodukte sind unter anderem das für die Neubildung von Erythrozyten verantwortliche Erythropoietin (EPO), aber auch pro-angiogene Wachstumsfaktoren wie VEGF und Proteine des zellulären Glukose- Stoffwechsels (z.B. GLUT1, PDK1). Die enzymatische Aktivität von PHDs ist unmittelbar an die Verfügbarkeit von Sauerstoff gekoppelt, aber auch andere Kofaktoren und Kosubstrate beeinflussen ihre spezifische Hydroxylierungskapazität. Die Nutzung eines Hydroxylierungsassays als rekonstituiertes System erlaubte uns, die Abhängigkeit aller drei PHD Isoformen von verschiedenen einfachen, potentiell inhibierenden oder aktivierenden Substanzen („small molecules“) zu untersuchen. Während die enzymatische Aktivität von PHDs in Gegenwart von Eisen(II), 2-Oxoglutarat und Ascorbat dosisabhängig gesteigert war, inhibierten Substanzen wie Succinat oder polyphenolische Antioxidantien die Hydroxylierungs-aktivität der PHDs. Übergangsmetalle wie Kobalt(II) und Zink(II), chelierende Agenzien (DFX, EDTA) und reaktive Sauerstoffspezies (Wasserstoffperoxid) waren weitere effiziente Hemmstoffe der PHDs. Mechanistisch funktionieren diese Substanzen zumindest teilweise durch die Abreicherung oder Inaktivierung eines oder mehrerer der für die Hydroxylierungs-reaktion notwendigen Kofaktoren. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, dass Kupfer(II), jedoch nicht Kobalt(II) oder Eisen(II), die Oxidation von Ascorbat zu Dehydroascorbat katalysieren kann, wobei letzteres keinen aktivierenden Einfluss mehr auf die PHDs ausübt. Eine Mangelversorgung mit Ascorbat (Vitamin C) verursacht die als Skorbut bekannte Systemerkrankung mit unzureichender Quervernetzung des Kollagens im Bindegewebe, der eine verminderte Aktivität der Kollagen- Prolyl-4-Hydroxylasen zugrunde liegt. Da PHDs zur gleichen Untergruppe von Enzymen wie Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylasen gehören, wurde in dieser Arbeit ein möglicher Einfluss von Ascorbat auf Mechanismen der Sauerstoff-Rezeption in vivo untersucht. Hierzu fand ein genetisch modifiziertes Tiermodell mit Mäusen Verwendung, die eine biallelische Inaktivierung des L-Gulonolacton Oxidasegens (Gulo) aufweisen, das für ein Schlüsselenzym zur körpereigenen Synthese von Ascorbat kodiert. Folglich sind diese Tiere abhängig von der Aufnahme von Ascorbat mit der Nahrung. Im Vergleich zu Tieren, die Ascorbat mit dem Trinkwasser erhielten, zeigten Gulo-/- Mäuse, denen fünf Wochen lang eine Ascorbat-freie Diät gefüttert wurde, keine wesentlichen Änderungen in der Expression von HIF Zielgenen. Ausserdem konnten keine merklichen Unterschiede zwischen beiden Behandlungsgruppen in der Expression von EPO mRNA in der Niere und zirkulierendem EPO Protein im Plasma nach einer 24-stündigen hypoxischen Episode mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von ca. 8% O2 festgestellt werden. Unsere Daten legen nahe, dass eine Ascorbat-Defizienz keinen Einfluss auf die systemische Adaptation an Sauerstoffmangelzustände hat und die Rolle von Ascorbat im Organismus durch andere Antioxidantien kompensiert werden kann. Diese Hypothese findet zusätzlich Unterstützung in der Beobachtung, dass humane Zervixkarzinom-Zellen, die unter vollständig Ascorbat-freien Kulturbedingungen gehalten wurden, eine identische hypoxische HIF-1α Stablilisierung und transkriptionelle HIF Aktivität zeigten wie Zellen, die in Gegenwart von 50 μM Ascorbat wuchsen. Glutathion (GSH) ist das weitaus verbreitetste Antioxidant in menschlichen Zellen, weswegen wir den Einfluss von GSH auf die enzymatische Aktivität von PHDs in vitro untersucht haben. Tatsächlich wurden alle drei PHD Isoformen in dosisabhängiger Weise durch GSH aktiviert. Analog zur Behandlung mit Ascorbat zeigten humane Hepatomazellen in Gegenwart von GSH einen reduzierten HIF-1α Proteingehalt, wie auch die transkriptionelle Aktivität von Kobalt(II)-induziertem HIF vermindert war. Desweiteren veringerte Glutathion die durch Fenton-Reaktion bzw. Kobalt(II)- und Wasserstoffperoxid-vermittelte Proteinoxidation von rekombinantem PHD2 Enzym, wie durch das Messen der Proteinkarbonylierung bestimmt wurde. Interessanterweise konnte die Mutation des Cysteinrestes an Position 201 des Proteins zu Serin die basale Hydroxylierungsaktivität von PHD2 erhöhen und steigerte die Resistenz des rekombinanten Proteins gegenüber oxidativen Noxen. Dieser strukturell zugängliche und konservierte Cysteinrest stellt daher einen möglichen Angriffspunkt zur antioxidativen Aktivierung von PHDs durch Vitamin C und Glutathion dar. Summary Oxygen sensing by prolyl-4-hydroxylases domain (PHD) proteins is involved in many physiological as well as pathophysiological processes in the human body. Hypoxia-inducible factors (HIFs) are the prime hydroxylation targets of PHDs and function as oxygen regulated transcription factors controlling the expression of more than 100 target genes. Genes involved in erythropoiesis (e.g. EPO), angiogenesis (e.g. VEGF) as well as glucose transport and metabolism (e.g. GLUT1, PDK1) are the most prominent examples of HIF-regulated genes. PHD activity is regulated primarily by the availability of oxygen but also other co-factors and co-substrates can affect their hydroxylation capacity. Using a reconstituted hydroxylation assay we attempted to investigate the dependency of all three PHDs isoforms on different types of small molecule activators and inhibitors. While addition of iron (II), 2-oxoglutarate and ascorbate was enhancing PHD activity in a dose-dependent manner, other compounds such as succinate or polyphenolic antioxidants were inhibiting hydroxylation activity of all three PHDs. Transition metals (cobalt (II), zinc (II)), metal chelators (DFX, EDTA) and reactive oxygen species (hydrogen peroxide) were efficient inhibitors of PHD activity. The mechanisms of action of these compounds could be explained at least partially by depletion of one of the co-factors necessary for the hydroxylation reaction. We could show that copper (II), but not cobalt (II) and iron (II) catalysed oxidation of ascorbate to dehydroascorbate, which is incapable to activate PHDs. Ascorbate deficiency is known to cause a systemic disorder called scurvy, resulting from insufficient hydroxylation of collagen by collagen prolyl-4-hydroxlases in connective tissues. PHDs belong to the same subclasses of enzymes as collagen prolyl-4-hydroxylases, therefore we attempted to investigate whether ascorbate deficiency can affect oxygen sensing mechanisms in vivo. We used a knock-out mouse model lacking the key enzyme involved in ascorbic acid synthesis, Gulono-1,4-lactone oxidase (Gulo) and as a consequence the animals depend on ascorbate supplementation in the diet. When Gulo-/- mice were kept for 5 weeks at an ascorbate-free diet, expression of HIF-target genes was unchanged if compared to control animals receiving ascorbate with the drinking water. Moreover, when Gulo-/- mice were exposed to inspiratory hypoxia (8% oxygen for 24 hours) after 5 weeks of ascorbate depletion, no significant changes to the ascorbate fed control group between Epo mRNA in the kidney and EPO plasma protein levels were observed. These data suggest, that ascorbate deficiency might be compensated by other antioxidants in vivo. In support with this notion, HeLa cells grown in the absence of ascorbate showed equal hypoxic stabilization of HIF-1α protein and HIF activity as cells supplemented with 50 μM ascorbate. The most abundant intracellular antioxidant in human cells is glutathione (GSH). Therefore we tested its influence on PHDs activity in vitro. All three PHDs were robustly activated by GSH in a dose-dependent manner. Similarly to ascorbate, GSH could reduced HIF1-α protein levels and HIF transcriptional activity in cobalt (II) treated hepatoma cells. Glutathione protected recombinant PHD2 enzyme from oxidation by Fenton reaction and cobalt (II) as measured by carbonylation of the PHD2 protein. Interestingly, a C201S mutation in PHD2 increased basal hydroxylation rates of the enzyme and conferred resistance to oxidative damage in vitro, suggesting that this structurally conserved and surface accessible cysteine residue could be a target of antioxidative protection of PHDs by vitamin C and glutathione.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Wenger Roland H, Stiehl Daniel P
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:18 Oct 2011 11:37
Last Modified:24 Sep 2019 17:41
Number of Pages:164
OA Status:Green
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