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Mechanism of regulation of protein kinase Aurora A in response to mitotic DNA damage


Bhatia, Payal. Mechanism of regulation of protein kinase Aurora A in response to mitotic DNA damage. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Mitose ist ein hochgradig geordneter Prozeß der sicher stellt daß das duplizierte Genom gleichmäßig auf die Tochterzellen aufgeteilt wird. Gelingt dies nicht, so geht genetische Information verloren was zu Aneuploidy führt, wie es oft in Krebszellen beobachtet werden kann. Mehrere mitotische Kinasen sind das Ziel von der „checkpoint“ Kinase welche DNS Schäden detektiert. Darunter sind Cdk1, Aurora A und Plk1 die signifikantesten Ziele des G2 „Checkpoints“. Aurora A, welche im Mittelpunkt dieser Studie steht, wird durch Schäden an der DNS während der G2 Phase inaktiviert. Dies führt zu einem ATM/ATR-Chk1 abhängigen Zellzyklus Arrest.
In dieser Studie werden die molekularen Mechanismen untersucht, welche zu DNS Schadens-bedingter Inhibition von Aurora A Aktivität führen. Wir konnten auch zeigen, daß Aurora A, ein Ziel der IR-induzierten DNS Schäden, während der Mitose ist. Wir haben einen Synchronisationsansatz benutzt welcher die Zellen in der Mitose blockieret, während welcher die Aurora A Kinase Aktivität am höchsten ist. Als Maß für die Aktivität, haben wir die Phosphorylierung von Aurora A an der „T-loop“ Aminosäure, T288 getestet, indem wir einen spezifischen Antikörper benutzt haben. Das Resultat bestätigt ein reduziertes Phospho-Signal, welches Indikativ ist für die reduzierte Kinase Aktivität. Indem wir den Verlust der Phosphorylierung an T320 gemessen haben, konnten wir bestätigen daß Protein Phosphatase 1 (PP1) aktiviert wurde durch mitotische DNS Schäden. Diese ist eine Cdk1 abhängige Phosphorylierunsstelle in PP1. Dies deutet an, daß PP1 die Phosphatase ist welche für die Aurora A T228 dephosphorylierung verantwortlich ist.
Während der Mitose ist TPX2, ein Mikrotubulus assoziiertes Protein, der Hauptregulator von Aurora A. TPX2 bindet Aurora A und erleichtert dessen Lokalisierung an den mitotischen Spindelapparat und zusätzlich aktiviert es Aurora A indem es T228 vor einer dephosphorylierung durch PP1 bewahrt. Diese Interaktion sorgt dafür daß die Kinase währen der Mitose in einer aktiven Konformation bleibt. Wir haben eine Inaktivierung von Aurora A durch mitotischen IR Schaden beobachtet, welche mit dem auseinanderfallen des Aurora A-TPX2 Komplexes korelliert. Dies wiederum ist das Resultat eines verminderten TPX2 Protein Niveaus. Indem wir Cycloheximid benutzt haben um die Protein Synthese zu inhibieren konnten wir feststellen daß als Antwort auf mitotische DNS Schäden, TPX2 sehr unstabil wurde. TPX2 wird durch die APC-Cdh1 Proteasom Kaskade degradiert. Wir konnten zeigen, daß eine Reduktion der TPX2 Gesamtpopulation signifikant durch Post-translationale Kontrollmechanismen beeinflußt wird, da das TPX2 mRNA Niveau durch DNS Schäden unbeeinflußt blieb. Ein erster Versuch, diese Kaskaden zu identifizieren deutet einen Defekt während dem Prozeß der Translationsinitiation an. Dies wird reflektiert durch die Reduzierte Menge an TPX2 welche mit den aktiv translatierenden Einheiten, den Polysomen Assoziiert.
Zusammengefaßt deuten unsere Resultate darauf hin, daß mitotische DNS Schäden die Instabilität von TPX2 erhöht. Dadurch daß weniger TPX2 neu synthetisiert wird, kommt es zu einem Ungleichgewicht des existierenden Protein Haushalts. Dies beeinflußt den Aurora A-TPX2 Komplex, was wiederum dazu führt daß die pT288 Phosphorylierungsstelle von aktivem PP1 angegriffen wird und somit Aurora A inaktiviert.


Summary
Mitosis is a highly ordered collection of events that ensures that the duplicated genome is distributed to the daughter cells equally. A failure to do so results in loss of genetic information leading to aneuploidy, a condition frequently associated with cancer. Several mitotic kinases are targets of the DNA damage checkpoint: Cdk1, Aurora A and Plk1 being the most significant targets of the G2 checkpoint. Aurora A, the focus of study presented in this thesis, was shown to be inactivated by DNA damage induced in the G2 phase, leading to cell cycle arrest in an ATM/ATR-Chk1 dependent manner.
In the present study, we addressed the molecular mechanism leading to DNA damage-induced inhibition of Aurora A activity. We show that Aurora A is also a target of IR- induced DNA damage occurring in mitosis. We used a synchronization approach that arrests cells in mitosis where Aurora A kinase activity is at the peak. As a measure of its activity, we tested the phosphorylation of Aurora A at the T-loop residue, T288, using specific antibody. The results confirmed a decreased phospho-signal, indicative of reduced kinase activity. We confirmed that protein phosphatase 1 (PP1) was activated by mitotic DNA damage by scoring the loss of phosphorylation at T320, a Cdk1-dependent phosphosite in PP1, indicating with high probability that this is the phosphatase responsible for Aurora A T288 dephosphorylation.
During mitosis, TPX2, a microtubule-associated protein, is the main regulator of Aurora A. TPX2 binds to Aurora A facilitating its localization to mitotic spindles and, in addition, activates it by protecting T288 from PP1-mediated dephosphorylation. This interaction ensures that the kinase is locked in an active conformation throughout mitosis. Upon IR-induced mitotic damage, we observed inactivation of Aurora A in a manner that was directly linked to disruption of the Aurora A-TPX2 complex. This, in turn, was the result of decreased TPX2 protein level. By employing cycloheximide to prevent any nascent protein synthesis, we found that in response to mitotic DNA damage, TPX2 became highly unstable, being degraded by the APC-Cdh1 proteasome pathway with faster kinetic than in control cells. We showed that decrease of the overall population of TPX2 was also significantly contributed by post-transcriptional control mechanisms, as the TPX2 mRNA level remained unvaried in the presence of damage. An initial attempt to identify these pathways indicated a defect in the process of translation initiation, as seen by the reduced level of TPX2 mRNA that was able to associate with the actively translating units, the polysomes.
Collectively, our results indicate that upon mitotic DNA damage, increased TPX2 protein instability and, particularly, lack of new TPX2 synthesis results in an overall unbalance of the existing protein pool in a manner that affects the Aurora A-TPX2 complex. This, in turn, exposes the pT288 site to activated PP1 resulting in inactivation of Aurora A.

Abstract

Die Mitose ist ein hochgradig geordneter Prozeß der sicher stellt daß das duplizierte Genom gleichmäßig auf die Tochterzellen aufgeteilt wird. Gelingt dies nicht, so geht genetische Information verloren was zu Aneuploidy führt, wie es oft in Krebszellen beobachtet werden kann. Mehrere mitotische Kinasen sind das Ziel von der „checkpoint“ Kinase welche DNS Schäden detektiert. Darunter sind Cdk1, Aurora A und Plk1 die signifikantesten Ziele des G2 „Checkpoints“. Aurora A, welche im Mittelpunkt dieser Studie steht, wird durch Schäden an der DNS während der G2 Phase inaktiviert. Dies führt zu einem ATM/ATR-Chk1 abhängigen Zellzyklus Arrest.
In dieser Studie werden die molekularen Mechanismen untersucht, welche zu DNS Schadens-bedingter Inhibition von Aurora A Aktivität führen. Wir konnten auch zeigen, daß Aurora A, ein Ziel der IR-induzierten DNS Schäden, während der Mitose ist. Wir haben einen Synchronisationsansatz benutzt welcher die Zellen in der Mitose blockieret, während welcher die Aurora A Kinase Aktivität am höchsten ist. Als Maß für die Aktivität, haben wir die Phosphorylierung von Aurora A an der „T-loop“ Aminosäure, T288 getestet, indem wir einen spezifischen Antikörper benutzt haben. Das Resultat bestätigt ein reduziertes Phospho-Signal, welches Indikativ ist für die reduzierte Kinase Aktivität. Indem wir den Verlust der Phosphorylierung an T320 gemessen haben, konnten wir bestätigen daß Protein Phosphatase 1 (PP1) aktiviert wurde durch mitotische DNS Schäden. Diese ist eine Cdk1 abhängige Phosphorylierunsstelle in PP1. Dies deutet an, daß PP1 die Phosphatase ist welche für die Aurora A T228 dephosphorylierung verantwortlich ist.
Während der Mitose ist TPX2, ein Mikrotubulus assoziiertes Protein, der Hauptregulator von Aurora A. TPX2 bindet Aurora A und erleichtert dessen Lokalisierung an den mitotischen Spindelapparat und zusätzlich aktiviert es Aurora A indem es T228 vor einer dephosphorylierung durch PP1 bewahrt. Diese Interaktion sorgt dafür daß die Kinase währen der Mitose in einer aktiven Konformation bleibt. Wir haben eine Inaktivierung von Aurora A durch mitotischen IR Schaden beobachtet, welche mit dem auseinanderfallen des Aurora A-TPX2 Komplexes korelliert. Dies wiederum ist das Resultat eines verminderten TPX2 Protein Niveaus. Indem wir Cycloheximid benutzt haben um die Protein Synthese zu inhibieren konnten wir feststellen daß als Antwort auf mitotische DNS Schäden, TPX2 sehr unstabil wurde. TPX2 wird durch die APC-Cdh1 Proteasom Kaskade degradiert. Wir konnten zeigen, daß eine Reduktion der TPX2 Gesamtpopulation signifikant durch Post-translationale Kontrollmechanismen beeinflußt wird, da das TPX2 mRNA Niveau durch DNS Schäden unbeeinflußt blieb. Ein erster Versuch, diese Kaskaden zu identifizieren deutet einen Defekt während dem Prozeß der Translationsinitiation an. Dies wird reflektiert durch die Reduzierte Menge an TPX2 welche mit den aktiv translatierenden Einheiten, den Polysomen Assoziiert.
Zusammengefaßt deuten unsere Resultate darauf hin, daß mitotische DNS Schäden die Instabilität von TPX2 erhöht. Dadurch daß weniger TPX2 neu synthetisiert wird, kommt es zu einem Ungleichgewicht des existierenden Protein Haushalts. Dies beeinflußt den Aurora A-TPX2 Komplex, was wiederum dazu führt daß die pT288 Phosphorylierungsstelle von aktivem PP1 angegriffen wird und somit Aurora A inaktiviert.


Summary
Mitosis is a highly ordered collection of events that ensures that the duplicated genome is distributed to the daughter cells equally. A failure to do so results in loss of genetic information leading to aneuploidy, a condition frequently associated with cancer. Several mitotic kinases are targets of the DNA damage checkpoint: Cdk1, Aurora A and Plk1 being the most significant targets of the G2 checkpoint. Aurora A, the focus of study presented in this thesis, was shown to be inactivated by DNA damage induced in the G2 phase, leading to cell cycle arrest in an ATM/ATR-Chk1 dependent manner.
In the present study, we addressed the molecular mechanism leading to DNA damage-induced inhibition of Aurora A activity. We show that Aurora A is also a target of IR- induced DNA damage occurring in mitosis. We used a synchronization approach that arrests cells in mitosis where Aurora A kinase activity is at the peak. As a measure of its activity, we tested the phosphorylation of Aurora A at the T-loop residue, T288, using specific antibody. The results confirmed a decreased phospho-signal, indicative of reduced kinase activity. We confirmed that protein phosphatase 1 (PP1) was activated by mitotic DNA damage by scoring the loss of phosphorylation at T320, a Cdk1-dependent phosphosite in PP1, indicating with high probability that this is the phosphatase responsible for Aurora A T288 dephosphorylation.
During mitosis, TPX2, a microtubule-associated protein, is the main regulator of Aurora A. TPX2 binds to Aurora A facilitating its localization to mitotic spindles and, in addition, activates it by protecting T288 from PP1-mediated dephosphorylation. This interaction ensures that the kinase is locked in an active conformation throughout mitosis. Upon IR-induced mitotic damage, we observed inactivation of Aurora A in a manner that was directly linked to disruption of the Aurora A-TPX2 complex. This, in turn, was the result of decreased TPX2 protein level. By employing cycloheximide to prevent any nascent protein synthesis, we found that in response to mitotic DNA damage, TPX2 became highly unstable, being degraded by the APC-Cdh1 proteasome pathway with faster kinetic than in control cells. We showed that decrease of the overall population of TPX2 was also significantly contributed by post-transcriptional control mechanisms, as the TPX2 mRNA level remained unvaried in the presence of damage. An initial attempt to identify these pathways indicated a defect in the process of translation initiation, as seen by the reduced level of TPX2 mRNA that was able to associate with the actively translating units, the polysomes.
Collectively, our results indicate that upon mitotic DNA damage, increased TPX2 protein instability and, particularly, lack of new TPX2 synthesis results in an overall unbalance of the existing protein pool in a manner that affects the Aurora A-TPX2 complex. This, in turn, exposes the pT288 site to activated PP1 resulting in inactivation of Aurora A.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Ferrari Stefano, Jiricny J, Meraldi P, Simanis Viesturs
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > Institute of Molecular Cancer Research
07 Faculty of Science > Institute of Molecular Cancer Research

UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:31 Oct 2011 13:18
Last Modified:28 May 2020 16:23
Number of Pages:206
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/permalink/f/5u2s2l/ebi01_prod006630962 (Library Catalogue)

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