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Novel insights into the molecular pathogenesis of gastric MALT lymphoma


Craig, Vanessa Jane. Novel insights into the molecular pathogenesis of gastric MALT lymphoma. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Gastric marginal zone B-cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT lymphoma) represents a distinct class of extranodal lymphoma that evolves against a background of chronic inflammation induced by persistent infection with the bacterium Helicobacter pylori. In its early stages, MALT lymphoma is an antigen-dependent disease characterised by an indolent clinical course and in most cases is treatable by antibiotic eradication therapy alone. Low grade MALT lymphomas can eventually undergo high grade transformation to a more aggressive counterpart termed gastric diffuse large B-cell lymphoma (gDLBCL). At this stage the lymphomas grow autonomously and are refractory to Helicobacter eradication therapy. Little is known about the molecular mechanisms governing the development of low grade MALT lymphoma and its ultimate progression to gDLBCL. To improve our current understanding of the molecular pathogenesis of MALT lymphoma, a multidimensional approach was taken to investigate various aspects of this disease during the course of my PhD thesis. Although a variety of circumstantial evidence has implicated an important role for antigen in MALT lymphomagenesis, the identity of such ligands recognised by the tumour cells remain unclear. To address this issue of antigen-receptor specificity, enzyme immunoassays were employed to systematically analyse the antigen binding profile of a comprehensive panel of human and murine recombinant MALT lymphoma-derived antibodies. The majority of tumour derived immunoglobulins were found to exhibit a broad reactivity profile in line with the definition of polyreactivity. In addition, using the BALB/c mouse model of Helicobacter-induced gastric MALT lymphoma, we demonstrated that explanted tumour cells proliferated in response to a variety of cognate antigens recognised by their polyreactive B-cell receptor. Our results therefore suggest that MALT lymphoma development may be facilitated by an array of local self- and foreign antigens, providing direct antigenic stimulation of the tumour cells via their B-cell receptor. A characteristic feature of gastric MALT lymphomas is that they are typically infiltrated by large numbers of T-helper cells producing interleukin-4 (IL4) and other T- helper cell type 2 cytokines. Therefore, an additional aim of this study was to elucidate the pathogenic role of the tumour-infiltrating T-cell population. Tumour cell proliferation was strongly enhanced by the presence of intratumoural CD4+ T cells in a CD40/CD40L- independent manner. Another key finding was that a substantial fraction of tumour- infiltrating CD4+ T cells were functional CD25+FoxP3+ regulatory T (Treg) cells. These cells were found to be recruited by the tumour cells themselves through secretion of the Treg- attracting chemokines CCL17 and CCL22. Interestingly, the depletion of CD25+ T cells was as efficient as CD4+ T-cell depletion in blocking tumour growth ex vivo and in vivo. Judging from our data, we propose that MALT lymphoma cells require at least two independent signals for proliferation. One signal is received by the functional surface-bound polyreactive immunoglobulin, while the other signal is delivered by tumour-infiltrating T cells, in particular by Tregs, which are likely to play a direct role in stimulating tumour growth.
To date, MALT lymphoma research has largely focused on altered expression of protein coding genes. However, recent evidence suggests that alterations of non-coding RNA, particularly microRNA (miRNA), also contribute to tumorigenesis. Using a genome-wide microarray-based approach, we defined the unique miRNA expression signature associated with the development and progression of this disease. A special focus was first laid upon miR-203 and its putative tumour suppressive function during the progression from reactive Helicobacter-specific gastritis to MALT lymphoma. We identified miR-203 to be significantly downregulated in MALT lymphoma tissue due to hypermethylation of the miR- 203 locus. The restoration of miR-203 expression in primary MALT lymphoma cells repressed the recently identified miR-203 target, ABL1, and blocked tumour cell proliferation. Finally, pharmacological inhibition of ABL1 activity by imatinib blocked MALT lymphoma cell proliferation ex vivo and effectively eradicated tumours in vivo. Collectively, our observations suggest that ABL1 plays an important role in MALT lymphoma cell biology and support a novel potential application of imatinib in the treatment of MALT lymphoma.
Our genome-wide survey further revealed a characteristic set of MYC-repressed miRNAs to be specifically downregulated in human gDLBCL compared to MALT lymphoma and gastritis. Aberrant MYC expression indeed correlated with high grade transformation as evident from our tissue microarray analysis. The re-expression of a panel of selected MYC-associated miRNAs significantly reduced the proliferation of DLBCL cells. In particular, miR-34a was found to represent the most potent tumour suppressor in DLBCL cell lines. We could further attribute the tumour suppressive effects of miR-34a to dysregulation of its target FOXP1. Accordingly, FOXP1 overexpression was found to be strongly associated with gDLBCL and the transient knockdown of FOXP1 in DLBCL cell lines significantly impaired the proliferation of the tumour cells. Taken together, our findings elucidate a novel mechanism linking the aberrant expression of MYC and concomitant repression of miR-34a to FOXP1 deregulation in high grade transformation of MALT lymphoma.


ZUSAMMENFASSUNG
Gastrische Marginalzonen-B-Zell Lymphome des Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebes (MALT Lymphome) stellen eine eigene Klasse der extranodalen Lymphome dar, die sich nach chronischer Magenentzündung infolge persistierender Infektion mit dem bakteriellen Humanpathogen Helicobacter pylori bilden. Im Frühstadium zeichnen sich MALT Lymphome durch einen relativ indolenten klinischen Verlauf aus; in der Mehrheit der Fälle können die früh diagnostizierten Lymphome aufgrund ihrer Abhängigkeit von der Helicobacter-Infektion durch eine antibiotische Therapie geheilt werden. Niedrigmaligne MALT Lymphome können sich potentiell in hochmaligne, aggressive Lymphome entwickeln, welche dann als „grosszelliges B-Zelllymphom des Magens“ (gDLBCL) bezeichnet werden. In diesem Stadium sind die Lymphome antigenunabnängig und lassen sich durch Helicobacter-Eradikation nicht behandeln. Über die molekularen Mechanismen der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms zu gDLBCL ist bisher nur wenig bekannt. Um den jetzigen Wissensstand über die molekulare Pathogenese der MALT Lymphome zu verbessern, haben wir während meiner Dissertation einen multidimensionalen Ansatz verfolgt, welcher diverse Aspekte dieser Krankheit beleuchtet hat. Obwohl eine Vielzahl von Resultaten zeigen, dass Antigene eine entscheidenden Rolle bei der Entwicklung von MALT Lymphomen spielen, war bisher unklar, ob diese von oberflächenständigen Immunglobulinen der Tumorzellen erkannt werden können. Um die Antigen-Spezifität der Tumorimmunglobuline zu untersuchen, haben wir ELISA-Experimente zur systematischen Analyse des Antigenbindungsprofils durchgeführt. Hierzu haben wir humane wie auch murine Antikörper untersucht, welche von MALT Lymphomen stammen. Die Mehrzahl dieser Immunoglobuline besitzt ein breites, „polyreaktives“ Reaktionsspektrum, d.h. sie reagieren jeweils mit einer Vielzahl von Antigenen. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass explantierte Tumorzellen über ihren polyreaktiven B-Zell Rezeptor verschiedene Antigene erkennen und durch sie zur Proliferation angeregt werden können.
Ein charakteristisches Merkmal der gastrischen MALT Lymphome ist, dass sie typischerweise durch eine grosse Anzahl von T-Helferzellen infiltriert werden, welche Interleukin-4 und andere Th2 Zytokine produzieren. Demzufolge war es ein weiteres Ziel meiner Arbeit, die pathogene Rolle der tumorinfiltrierenden T-Zellen aufzuklären. Wir konnten zeigen, dass die Vermehrung der Tumorzellen durch die Gegenwart von eingewanderten CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit von der CD40/CD40L Interaktion verstärkt wird. Eine weitere entscheidende Erkenntnis war, dass ein signifikanter Teil der tumor- infiltrierenden CD4+ T-Zellen aus funktionalen CD25+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) besteht. Diese Zellen wurden durch die Tumorzellen aktiv durch Sekretion der Chemokine CCL17 und CCL22 rekrutiert, welche Treg anlocken. Interessanterweise konnten wir beobachten, dass das Tumorwachstum ex vivo wie in vivo durch Depletion der CD25+ T- Zellen oder der CD4+ T-Zellen gehemmt werden konnte. Aus diesen Erkenntnissen schliessen wir, dass MALT Lymphome mindestens zwei Signale zur Proliferation benötigen. Eines dieser Signale wird durch die funktionalen polyreaktiven Immunoglobuline auf der Oberfläche übermittelt. Das andere Signal wird hingegen durch tumorinfiltrierende T-Zellen, insbesondere Treg, vermittelt, welche möglicherweise eine direkte Rolle bei der Stimulation des Tumorwachstums spielen.
In der MALT Lymphom-Forschung wurden bis heute überwiegend Expressionsveränderungen von proteinkodierenden Genen betrachtet, wobei neue Forschungsergebnisse zeigen, dass nicht-kodierende RNA, insbesondere microRNA (miRNA) in der Tumorentstehung eine entscheidende Rolle spielen können. Mit Hilfe eines microarraybasierten, genomweiten Ansatzes konnten wir miRNA-Expressionsmuster beschreiben, die mit der Entwicklung dieser Krankheit korrelieren. Ein Schwerpunkt lag dabei auf miR-203 und der tumorsuppressiven Funktion dieser miRNA bei der Progression von Helicobacter-abhängiger Gastritis zum MALT Lypmhom. Die Expression von miR-203 war im MALT Lymphomgewebe durch Hypermethylierung des miR-203 Locus signifikant herunterreguliert. Die experimentelle Überexpression von miR-203 in primären MALT Lymphomzellen unterdrückt das kürzlich identifizierte Target ABL1 und hemmt die Proliferation der Tumorzellen. Zudem konnten wir zeigen, dass die Inhibition der ABL1- Aktivität durch Imatinib die Vermehrung der MALT Lymphomzellen ex vivo hemmt und die Tumorentstehung im Tiermodell effizient unterdrückt. ABL1 scheint somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von MALT Lymphomen zu spielen; folglich kann Imatinib für die Behandlung von MALT Lymphompatienten in Betracht gezogen werden.
Unsere Genomanalyse hat weiterhin gezeigt, dass eine bestimmte Gruppe von MYC- reprimierten miRNAs in humanen gDLBCL im Vergleich zu MALT Lymphomen und Gastritis herunterreguliert sind. Wie wir in Gewebearray-Analysen immunhistochemisch zeigen konnten, korreliert eine aberrante MYC-Expression tatsächlich mit der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms. In der Tat kann die Proliferation von DLBCL Zellen durch experimentelle Re-Expression der MYC-regulierten miRNAs deutlich reduziert werden. Die miR-34a hat dabei die stärksten tumorsuppressiven Eigenschaften in DLCBL Zelllinien gezeigt, welche wir auf eine Dysregulierung des miR-34a Targets FOXP1 zurück- führen konnten. Übereinstimmend mit diesen Resultaten haben wir eine Korrelation zwischen FOXP1 Überexpression und hochgradiger Transformation des MALT Lymphoms beobachtet; zudem hat ein transienter Knockdown von FOXP1 in DLBCL Zelllinien die Proliferation von Tumorzellen deutlich gehemmt. Unsere Ergebnisse stellen somit einen Zusammenhang her zwischen der Überexpression von MYC, der daraus resultierenden Repression von miR-34a und anderen MYC-reprimierten miRNAs, und der Überexpression von FOXP1, welche mit der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms korrelieren und diese möglicherweise verursachen können.

Abstract

Gastric marginal zone B-cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT lymphoma) represents a distinct class of extranodal lymphoma that evolves against a background of chronic inflammation induced by persistent infection with the bacterium Helicobacter pylori. In its early stages, MALT lymphoma is an antigen-dependent disease characterised by an indolent clinical course and in most cases is treatable by antibiotic eradication therapy alone. Low grade MALT lymphomas can eventually undergo high grade transformation to a more aggressive counterpart termed gastric diffuse large B-cell lymphoma (gDLBCL). At this stage the lymphomas grow autonomously and are refractory to Helicobacter eradication therapy. Little is known about the molecular mechanisms governing the development of low grade MALT lymphoma and its ultimate progression to gDLBCL. To improve our current understanding of the molecular pathogenesis of MALT lymphoma, a multidimensional approach was taken to investigate various aspects of this disease during the course of my PhD thesis. Although a variety of circumstantial evidence has implicated an important role for antigen in MALT lymphomagenesis, the identity of such ligands recognised by the tumour cells remain unclear. To address this issue of antigen-receptor specificity, enzyme immunoassays were employed to systematically analyse the antigen binding profile of a comprehensive panel of human and murine recombinant MALT lymphoma-derived antibodies. The majority of tumour derived immunoglobulins were found to exhibit a broad reactivity profile in line with the definition of polyreactivity. In addition, using the BALB/c mouse model of Helicobacter-induced gastric MALT lymphoma, we demonstrated that explanted tumour cells proliferated in response to a variety of cognate antigens recognised by their polyreactive B-cell receptor. Our results therefore suggest that MALT lymphoma development may be facilitated by an array of local self- and foreign antigens, providing direct antigenic stimulation of the tumour cells via their B-cell receptor. A characteristic feature of gastric MALT lymphomas is that they are typically infiltrated by large numbers of T-helper cells producing interleukin-4 (IL4) and other T- helper cell type 2 cytokines. Therefore, an additional aim of this study was to elucidate the pathogenic role of the tumour-infiltrating T-cell population. Tumour cell proliferation was strongly enhanced by the presence of intratumoural CD4+ T cells in a CD40/CD40L- independent manner. Another key finding was that a substantial fraction of tumour- infiltrating CD4+ T cells were functional CD25+FoxP3+ regulatory T (Treg) cells. These cells were found to be recruited by the tumour cells themselves through secretion of the Treg- attracting chemokines CCL17 and CCL22. Interestingly, the depletion of CD25+ T cells was as efficient as CD4+ T-cell depletion in blocking tumour growth ex vivo and in vivo. Judging from our data, we propose that MALT lymphoma cells require at least two independent signals for proliferation. One signal is received by the functional surface-bound polyreactive immunoglobulin, while the other signal is delivered by tumour-infiltrating T cells, in particular by Tregs, which are likely to play a direct role in stimulating tumour growth.
To date, MALT lymphoma research has largely focused on altered expression of protein coding genes. However, recent evidence suggests that alterations of non-coding RNA, particularly microRNA (miRNA), also contribute to tumorigenesis. Using a genome-wide microarray-based approach, we defined the unique miRNA expression signature associated with the development and progression of this disease. A special focus was first laid upon miR-203 and its putative tumour suppressive function during the progression from reactive Helicobacter-specific gastritis to MALT lymphoma. We identified miR-203 to be significantly downregulated in MALT lymphoma tissue due to hypermethylation of the miR- 203 locus. The restoration of miR-203 expression in primary MALT lymphoma cells repressed the recently identified miR-203 target, ABL1, and blocked tumour cell proliferation. Finally, pharmacological inhibition of ABL1 activity by imatinib blocked MALT lymphoma cell proliferation ex vivo and effectively eradicated tumours in vivo. Collectively, our observations suggest that ABL1 plays an important role in MALT lymphoma cell biology and support a novel potential application of imatinib in the treatment of MALT lymphoma.
Our genome-wide survey further revealed a characteristic set of MYC-repressed miRNAs to be specifically downregulated in human gDLBCL compared to MALT lymphoma and gastritis. Aberrant MYC expression indeed correlated with high grade transformation as evident from our tissue microarray analysis. The re-expression of a panel of selected MYC-associated miRNAs significantly reduced the proliferation of DLBCL cells. In particular, miR-34a was found to represent the most potent tumour suppressor in DLBCL cell lines. We could further attribute the tumour suppressive effects of miR-34a to dysregulation of its target FOXP1. Accordingly, FOXP1 overexpression was found to be strongly associated with gDLBCL and the transient knockdown of FOXP1 in DLBCL cell lines significantly impaired the proliferation of the tumour cells. Taken together, our findings elucidate a novel mechanism linking the aberrant expression of MYC and concomitant repression of miR-34a to FOXP1 deregulation in high grade transformation of MALT lymphoma.


ZUSAMMENFASSUNG
Gastrische Marginalzonen-B-Zell Lymphome des Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebes (MALT Lymphome) stellen eine eigene Klasse der extranodalen Lymphome dar, die sich nach chronischer Magenentzündung infolge persistierender Infektion mit dem bakteriellen Humanpathogen Helicobacter pylori bilden. Im Frühstadium zeichnen sich MALT Lymphome durch einen relativ indolenten klinischen Verlauf aus; in der Mehrheit der Fälle können die früh diagnostizierten Lymphome aufgrund ihrer Abhängigkeit von der Helicobacter-Infektion durch eine antibiotische Therapie geheilt werden. Niedrigmaligne MALT Lymphome können sich potentiell in hochmaligne, aggressive Lymphome entwickeln, welche dann als „grosszelliges B-Zelllymphom des Magens“ (gDLBCL) bezeichnet werden. In diesem Stadium sind die Lymphome antigenunabnängig und lassen sich durch Helicobacter-Eradikation nicht behandeln. Über die molekularen Mechanismen der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms zu gDLBCL ist bisher nur wenig bekannt. Um den jetzigen Wissensstand über die molekulare Pathogenese der MALT Lymphome zu verbessern, haben wir während meiner Dissertation einen multidimensionalen Ansatz verfolgt, welcher diverse Aspekte dieser Krankheit beleuchtet hat. Obwohl eine Vielzahl von Resultaten zeigen, dass Antigene eine entscheidenden Rolle bei der Entwicklung von MALT Lymphomen spielen, war bisher unklar, ob diese von oberflächenständigen Immunglobulinen der Tumorzellen erkannt werden können. Um die Antigen-Spezifität der Tumorimmunglobuline zu untersuchen, haben wir ELISA-Experimente zur systematischen Analyse des Antigenbindungsprofils durchgeführt. Hierzu haben wir humane wie auch murine Antikörper untersucht, welche von MALT Lymphomen stammen. Die Mehrzahl dieser Immunoglobuline besitzt ein breites, „polyreaktives“ Reaktionsspektrum, d.h. sie reagieren jeweils mit einer Vielzahl von Antigenen. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass explantierte Tumorzellen über ihren polyreaktiven B-Zell Rezeptor verschiedene Antigene erkennen und durch sie zur Proliferation angeregt werden können.
Ein charakteristisches Merkmal der gastrischen MALT Lymphome ist, dass sie typischerweise durch eine grosse Anzahl von T-Helferzellen infiltriert werden, welche Interleukin-4 und andere Th2 Zytokine produzieren. Demzufolge war es ein weiteres Ziel meiner Arbeit, die pathogene Rolle der tumorinfiltrierenden T-Zellen aufzuklären. Wir konnten zeigen, dass die Vermehrung der Tumorzellen durch die Gegenwart von eingewanderten CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit von der CD40/CD40L Interaktion verstärkt wird. Eine weitere entscheidende Erkenntnis war, dass ein signifikanter Teil der tumor- infiltrierenden CD4+ T-Zellen aus funktionalen CD25+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) besteht. Diese Zellen wurden durch die Tumorzellen aktiv durch Sekretion der Chemokine CCL17 und CCL22 rekrutiert, welche Treg anlocken. Interessanterweise konnten wir beobachten, dass das Tumorwachstum ex vivo wie in vivo durch Depletion der CD25+ T- Zellen oder der CD4+ T-Zellen gehemmt werden konnte. Aus diesen Erkenntnissen schliessen wir, dass MALT Lymphome mindestens zwei Signale zur Proliferation benötigen. Eines dieser Signale wird durch die funktionalen polyreaktiven Immunoglobuline auf der Oberfläche übermittelt. Das andere Signal wird hingegen durch tumorinfiltrierende T-Zellen, insbesondere Treg, vermittelt, welche möglicherweise eine direkte Rolle bei der Stimulation des Tumorwachstums spielen.
In der MALT Lymphom-Forschung wurden bis heute überwiegend Expressionsveränderungen von proteinkodierenden Genen betrachtet, wobei neue Forschungsergebnisse zeigen, dass nicht-kodierende RNA, insbesondere microRNA (miRNA) in der Tumorentstehung eine entscheidende Rolle spielen können. Mit Hilfe eines microarraybasierten, genomweiten Ansatzes konnten wir miRNA-Expressionsmuster beschreiben, die mit der Entwicklung dieser Krankheit korrelieren. Ein Schwerpunkt lag dabei auf miR-203 und der tumorsuppressiven Funktion dieser miRNA bei der Progression von Helicobacter-abhängiger Gastritis zum MALT Lypmhom. Die Expression von miR-203 war im MALT Lymphomgewebe durch Hypermethylierung des miR-203 Locus signifikant herunterreguliert. Die experimentelle Überexpression von miR-203 in primären MALT Lymphomzellen unterdrückt das kürzlich identifizierte Target ABL1 und hemmt die Proliferation der Tumorzellen. Zudem konnten wir zeigen, dass die Inhibition der ABL1- Aktivität durch Imatinib die Vermehrung der MALT Lymphomzellen ex vivo hemmt und die Tumorentstehung im Tiermodell effizient unterdrückt. ABL1 scheint somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von MALT Lymphomen zu spielen; folglich kann Imatinib für die Behandlung von MALT Lymphompatienten in Betracht gezogen werden.
Unsere Genomanalyse hat weiterhin gezeigt, dass eine bestimmte Gruppe von MYC- reprimierten miRNAs in humanen gDLBCL im Vergleich zu MALT Lymphomen und Gastritis herunterreguliert sind. Wie wir in Gewebearray-Analysen immunhistochemisch zeigen konnten, korreliert eine aberrante MYC-Expression tatsächlich mit der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms. In der Tat kann die Proliferation von DLBCL Zellen durch experimentelle Re-Expression der MYC-regulierten miRNAs deutlich reduziert werden. Die miR-34a hat dabei die stärksten tumorsuppressiven Eigenschaften in DLCBL Zelllinien gezeigt, welche wir auf eine Dysregulierung des miR-34a Targets FOXP1 zurück- führen konnten. Übereinstimmend mit diesen Resultaten haben wir eine Korrelation zwischen FOXP1 Überexpression und hochgradiger Transformation des MALT Lymphoms beobachtet; zudem hat ein transienter Knockdown von FOXP1 in DLBCL Zelllinien die Proliferation von Tumorzellen deutlich gehemmt. Unsere Ergebnisse stellen somit einen Zusammenhang her zwischen der Überexpression von MYC, der daraus resultierenden Repression von miR-34a und anderen MYC-reprimierten miRNAs, und der Überexpression von FOXP1, welche mit der hochgradigen Transformation des MALT Lymphoms korrelieren und diese möglicherweise verursachen können.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Müller Anne, Cogliatti Sergio, Nadal D, Renner C
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > Institute of Molecular Cancer Research
07 Faculty of Science > Institute of Molecular Cancer Research

UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:31 Oct 2011 13:25
Last Modified:15 Apr 2021 14:13
Number of Pages:145
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green

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