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Functional characterization of 14-3-3 proteins and exonuclease 1 at stalled replication forks


Engels, Kim. Functional characterization of 14-3-3 proteins and exonuclease 1 at stalled replication forks. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

DNA replication and DNA repair are two tightly linked processes since, on the one hand, errors occurring during replication in germline cells might introduce mutations that are handed on to the next generation and, on the other hand, unrepaired DNA structures might cause replication blocks that threaten genome integrity. DNA and replication fork integrity are monitored by checkpoint-mediated phosphorylation events that trigger repair pathways. Exonuclease 1 (Exo1) processes stalled replication forks in checkpoint-defective yeast cells. While studying Exo1 and its regulation by phosphorylation and other post-translational modifications, we isolated an interesting group of novel in vivo interaction partners in yeast and mammalian cells, namely the 14-3-3 proteins. 14-3- 3’s are able to bind phosphorylated proteins and, in addition to their well-known ability to act as adaptors that integrate signals from different pathways, they were shown to play an undefined role under DNA replication stress. The finding that they interact with Exo1 led us to formulate the hypothesis that the 14-3-3/Exo1 complex might have a functional role at replication forks and encouraged us to investigate this possibility. Using DNA bi-dimensional electrophoresis, we could show that yeast 14-3-3’s promote fork progression under limiting nucleotide concentrations. 14-3-3-deficient cells fail to induce Mec1-dependent Exo1 hyper-phosphorylation and accumulate Exo1-dependent ssDNA gaps at stalled forks, as revealed by electron microscopy. This leads to persistent checkpoint activation and exacerbated recovery defects. Interestingly the fork progression defect in 14-3-3 cells cannot be rescued by Exo1 deletion and the recovery defect is only partially rescued by Exo1 deletion, suggesting that additionally to Exo1, 14-3-3 proteins might regulate the phosphorylation of other yet unknown targets in response to replication fork stalling. Based on this evidence, we propose that 14-3-3 proteins assist checkpoint-mediated phosphorylation of Exo1 and additional unknown targets, promoting fork progression, stability and restart in response to DNA replication stress.

ZUSAMMENFASSUNG
Die Replikation und die Reparatur der DNS sind zwei eng verknüpfte Prozesse. Auf der einen Seite können Fehler während der Replikation von Keimbahnzellen Mutationen hervorrufen welche an die nächste Generation weitervererbt werden. Andererseits können abnormale DNS Strukturen die Replikationsgabeln blockieren, was die Integrität des Genoms gefährden kann. Die Integrität der DNS und der Replikationsgabeln wird von Checkpoint-Kinasen überwacht, welche Reparatur Signalkaskaden auslösen können. In Hefezellen, welche einen Checkpoint Defekt haben, prozessiert Exo1 arretierte Replikationsgabeln. Während unserer Studie im Zusammenhang mit der Regulierung von Exo1 durch Phosphorylierung und andere post-translationalen Modifikationen, haben wir eine interessante Gruppe von bisher unbekannten in vivo Interaktionspartnern gefunden, die 14-3-3 Proteine. Diese sind in der Lage phosphorylierte Proteine zu binden und, zusätzlich zu ihren hinreichend bekannten Fähigkeiten als Adaptoren, welche Signale von verschiedenen Signalkaskaden integrieren, konnte gezeigt werden, daß sie eine bisher nicht genauer definierte Rolle während des DNS Replikationsstresses spielen. Die Isolation von 14-3-3 als Interaktionspartner von Exo1, hat uns ermuntert die von uns postulierte Hypothese zu untersuchen, welche besagt, daß der 14-3-3/Exo1 Komplex eine funktionelle Rolle an Replikationsgabeln spielt. Wir konnten anschließend dank der bi-dimensionalen Elektrophorese zeigen, daß, wenn die Nukleotidkonzentrationen limitierend sind, 14-3-3 Proteine die Progression der Replikationsgabeln fördern. In 14-3-3 defizienten Zellen wird die Mec1 abhängige Exo1 Hyperphosphorylierung nur mangelhaft induziert. Wie wir anhand der applizierten Elektronenmikroskopie zeigen konnten, akkumulieren die 14-3-3 defizienten Zellen Exo1 abhängige ssDNS Lücken an den arretierten Replikationsgabeln. Diese Lücken führen zu einer persistenten Checkpoint Aktivierung und Defekten bei der Erholung vom Replikationsblock. Interessanterweise kann der progressions-Defekt der Replikationsgabeln nicht durch die Deletion von EXO1 verhindert werden. Zusätzlich wird der Defekt während der Erholung vom Replikationsblock nur partiell durch die Deletion von EXO1 verhindert. Dies suggeriert, daß zusätzlich zu Exo1, 14-3-3 noch weitere bisher unbekannte Zielproteine über deren Phophorylierungs-Status reguliert, wenn es zu einer Blockierung der Replikationsgabeln kommt. Gestützt auf diese Resultate postulieren wir, daß 14-3-3 Proteine Checkpoint vermittelte Phosphorylierungen auf Exo1 und auf zusätzliche, bisher unbekannte Ziele, regulieren, wodurch sie die Progression, die Stabilität und den Neustart der Replikationsgabeln fördern.

Abstract

DNA replication and DNA repair are two tightly linked processes since, on the one hand, errors occurring during replication in germline cells might introduce mutations that are handed on to the next generation and, on the other hand, unrepaired DNA structures might cause replication blocks that threaten genome integrity. DNA and replication fork integrity are monitored by checkpoint-mediated phosphorylation events that trigger repair pathways. Exonuclease 1 (Exo1) processes stalled replication forks in checkpoint-defective yeast cells. While studying Exo1 and its regulation by phosphorylation and other post-translational modifications, we isolated an interesting group of novel in vivo interaction partners in yeast and mammalian cells, namely the 14-3-3 proteins. 14-3- 3’s are able to bind phosphorylated proteins and, in addition to their well-known ability to act as adaptors that integrate signals from different pathways, they were shown to play an undefined role under DNA replication stress. The finding that they interact with Exo1 led us to formulate the hypothesis that the 14-3-3/Exo1 complex might have a functional role at replication forks and encouraged us to investigate this possibility. Using DNA bi-dimensional electrophoresis, we could show that yeast 14-3-3’s promote fork progression under limiting nucleotide concentrations. 14-3-3-deficient cells fail to induce Mec1-dependent Exo1 hyper-phosphorylation and accumulate Exo1-dependent ssDNA gaps at stalled forks, as revealed by electron microscopy. This leads to persistent checkpoint activation and exacerbated recovery defects. Interestingly the fork progression defect in 14-3-3 cells cannot be rescued by Exo1 deletion and the recovery defect is only partially rescued by Exo1 deletion, suggesting that additionally to Exo1, 14-3-3 proteins might regulate the phosphorylation of other yet unknown targets in response to replication fork stalling. Based on this evidence, we propose that 14-3-3 proteins assist checkpoint-mediated phosphorylation of Exo1 and additional unknown targets, promoting fork progression, stability and restart in response to DNA replication stress.

ZUSAMMENFASSUNG
Die Replikation und die Reparatur der DNS sind zwei eng verknüpfte Prozesse. Auf der einen Seite können Fehler während der Replikation von Keimbahnzellen Mutationen hervorrufen welche an die nächste Generation weitervererbt werden. Andererseits können abnormale DNS Strukturen die Replikationsgabeln blockieren, was die Integrität des Genoms gefährden kann. Die Integrität der DNS und der Replikationsgabeln wird von Checkpoint-Kinasen überwacht, welche Reparatur Signalkaskaden auslösen können. In Hefezellen, welche einen Checkpoint Defekt haben, prozessiert Exo1 arretierte Replikationsgabeln. Während unserer Studie im Zusammenhang mit der Regulierung von Exo1 durch Phosphorylierung und andere post-translationalen Modifikationen, haben wir eine interessante Gruppe von bisher unbekannten in vivo Interaktionspartnern gefunden, die 14-3-3 Proteine. Diese sind in der Lage phosphorylierte Proteine zu binden und, zusätzlich zu ihren hinreichend bekannten Fähigkeiten als Adaptoren, welche Signale von verschiedenen Signalkaskaden integrieren, konnte gezeigt werden, daß sie eine bisher nicht genauer definierte Rolle während des DNS Replikationsstresses spielen. Die Isolation von 14-3-3 als Interaktionspartner von Exo1, hat uns ermuntert die von uns postulierte Hypothese zu untersuchen, welche besagt, daß der 14-3-3/Exo1 Komplex eine funktionelle Rolle an Replikationsgabeln spielt. Wir konnten anschließend dank der bi-dimensionalen Elektrophorese zeigen, daß, wenn die Nukleotidkonzentrationen limitierend sind, 14-3-3 Proteine die Progression der Replikationsgabeln fördern. In 14-3-3 defizienten Zellen wird die Mec1 abhängige Exo1 Hyperphosphorylierung nur mangelhaft induziert. Wie wir anhand der applizierten Elektronenmikroskopie zeigen konnten, akkumulieren die 14-3-3 defizienten Zellen Exo1 abhängige ssDNS Lücken an den arretierten Replikationsgabeln. Diese Lücken führen zu einer persistenten Checkpoint Aktivierung und Defekten bei der Erholung vom Replikationsblock. Interessanterweise kann der progressions-Defekt der Replikationsgabeln nicht durch die Deletion von EXO1 verhindert werden. Zusätzlich wird der Defekt während der Erholung vom Replikationsblock nur partiell durch die Deletion von EXO1 verhindert. Dies suggeriert, daß zusätzlich zu Exo1, 14-3-3 noch weitere bisher unbekannte Zielproteine über deren Phophorylierungs-Status reguliert, wenn es zu einer Blockierung der Replikationsgabeln kommt. Gestützt auf diese Resultate postulieren wir, daß 14-3-3 Proteine Checkpoint vermittelte Phosphorylierungen auf Exo1 und auf zusätzliche, bisher unbekannte Ziele, regulieren, wodurch sie die Progression, die Stabilität und den Neustart der Replikationsgabeln fördern.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Lopes Massimo, Ferrari S, Paszkowski Jerzy
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > Institute of Molecular Cancer Research
07 Faculty of Science > Institute of Molecular Cancer Research

UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:31 Oct 2011 13:29
Last Modified:29 May 2020 14:12
Number of Pages:98
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/permalink/f/5u2s2l/ebi01_prod006365060 (Library Catalogue)

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