Identification and treatment of splice defects in ciliary genes RPGR and BBS1 causing Retinitis pigmentosa

Abstract

Retinitis pigmentosa (RP) ist eine genetisch und klinisch heterogene Krankheit, die zur Degeneration von Photorezeptoren führt und vollständige Blindheit verursachen kann. Zirka eine von 3000 bis 4000 Personen erkrankt an RP und weltweit sind mind. 1.5 Millionen Menschen betroffen. RP kann auch Teil einer syndromalen Krankheit, wie zum Beispiel dem Bardet-Biedl Syndrom (BBS) sein. Wir haben Mutationen in den Genen RPGR und BBS1 gefunden, welche für das Funktionieren des Verbindenden Ziliums (connecting cilium) im Photorezeptor wichtig sind. Die Mutationen führen zu Defekten im Spleissen der pre-mRNA. Mutationen in BBS1 sind normalerweise mit BBS assoziiert, wohingegen die meisten RPGR Mutationen nicht syndromale RP verursachen. Unsere Patienten zeigen aber Symptome, die dem zu erwartenden Krankheitsbild widersprechen. In der Familie des einen Patienten mit Spleissdefekten in RPGR, sind heterozygote Trägerinnen der Mutation ebenfalls betroffen. Im anderen Fall leidet der Patient zusätzlich zu RP an einer milden Höhrschwäche. Die zwei Patienten mit der Splice Donor Mutation in BBS1 zeigen RP, aber keine weiteren Symptome von BBS. Unsere Beobachtungen deuten an, dass Spleissdefekte das Krankheitsbild und den Krankheitsverlauf modifizieren können. Die zwei RPGR Mutationen verändern die exprimierte Menge von neu entdeckten, alternativen RPGR Transkriptisoformen. Wir haben gefunden, dass deren Menge in gesunden Menschen gewebespezifisch reguliert ist. Dies impliziert, dass eine Misregulation dieser Isoformen Schäden in den entsprechenden Geweben verursachen oder den Schweregrad der Krankheit erhöhen könnte. Im Gegensatz dazu, führt die BBS1 Mutation zu RP, höchstwahrscheinlich durch eine Reduktion der Menge an funktionellem BBS1 Protein. Die reduzierte Menge an BBS1 scheint auf die anderen Gewebe aber keinen Einfluss zu haben. In unserer Gruppe wurde ein gentherapeutischer Ansatz entwickelt, um die pathogenen Effekte von Spleissendefekten zu mildern. Der Ansatz basiert auf der Expression einer modifizierten Form des U1 small nuclear Ribonukleoproteins (U1). U1 ist ein Spleissfaktor der direkt am Pozess des Transkriptspleissens beteiligt ist. Höchstwahrscheinlich stört die Mutation in BBS1 die Interaktion von U1 mit dem Transkript, was dadurch den Spleissdefekt verursacht. Um die Interaktion von U1 mit dem Transkript und damit die Erkennung des von der Mutation betroffenen Exons zu verbessern, wurde U1 an die Mutation angepasst. Die Behandlung von Patientenzellen mit dem angepassten U1 verhindert das Überspringen von Exon 5 und erhöht die Menge an korrekt gespleisstem BBS1 Transkript. Diese Resultate, werden möglicherweise dazu beitragen, eine Behandlungsmethode für solche Mutationen in betroffenen Patienten zu etablieren.

Summary
Retinitis pigmentosa (RP) is a genetically and clinically heterogeneous disease leading to the degeneration of photoreceptors and can cause complete blindness. The prevalence of the disease is about 1 in 3000 to 4000 people with more than 1.5 million affected worldwide. RP can be a part of several syndromic disorders, as for example the Bardet-Biedl syndrome (BBS). We have identified mutations in the genes RPGR and BBS1 which are important for the functioning of the photoreceptor’s connecting cilium. The mutations lead to defects in pre-mRNA splicing. Mutations in BBS1 are generally associated with BBS, whereas most of the mutations in RPGR cause non-syndromic RP. However, our patients show different phenotypes. In the family of one of the two male RP patients who show RPGR splice defects, heterozygous female carriers are affected. The other patient suffers from mild hearing impairments in addition to RP. Furthermore, the two patients with a splice site mutation in BBS1 show RP without any further signs of BBS. Our findings implicate that defects in mRNA splicing might modify progression and expression of the disease. The two mutations found in RPGR change the amount of novel, alternative transcript isoforms. We have found that the novel RPGR isoforms were expressed in a tissue-dependent manner in healthy individuals which suggests that misregulation of these variants could affect other tissues or increase disease severity. In contrast, the splice site mutation in BBS1 causes RP, most probably by reducing the amount of functional protein, whereas other tissues remain unaffected. To correct spliced defects a gene therapeutic approach using a modified form of the U1 small nuclear ribonucleoprotein has been developed in our group. U1 is a splicing factor directly involved in the general splicing process. The mutation in BBS1 causes the splice defect most probably by interfering with U1 binding to the transcript. To increase its binding affinity to the transcript and thereby improve recognition of the affected exon, U1 was adapted to the mutation. Treatment of patient-derived fibroblasts with the adapted form of U1 increased the amount of correctly spliced BBS1 transcripts and completely abolished skipping of exon 5. These results could help to establish a gene therapeutic treatment to correct splice defects in patients.