Functional analysis of the N-terminal segment of Agrin and characterization of the response of dendritic spines to cholinergic stimulation

Abstract

The synaptically released serine protease neurotrypsin is important for higher cognitive function, since its deficiency results in severe mental retardation. At the present time, the extracellular matrix proteoglycan agrin is the only identified substrate of neurotrypsin. Proteolytic processing of transmembrane agrin releases two fragments from the N- terminal moiety. The released C-terminal agrin-22 fragment promotes the formation of dendritic filopodia and thus contributes to structural plasticity in the brain. In this thesis, I analysed potential functions of the N-terminal agrin region which remains linked to the plasma membrane after cleavage. Microscopical and biochemical analysis revealed three regions within the agrin molecule that are capable of binding neurotrypsin. Two of them consist of glycosaminoglycan chains and are located in the N-terminal region of agrin. The third is a heparin binding site positioned in the C-terminal LG2 domain. Interaction of neurotrypsin with the glycosaminoglycan chains enhances the agrin cleavage process and suggests additional regulatory influence on the protease. N-terminal agrin contains several follistatin domains that have high affinity to bind several members of the TGF-β superfamily. I tested three of these cytokines on possible effects on synaptogenesis in dissociated neuron cultures. For the synapse quantification, I developed a new quantification method that enabled the automated processing of huge datasets. Finally, I studied the fate of the N-terminal segment of agrin after cleavage of full-length agrin by neurotrypsin. In the second part of my thesis I investigated morphological modifications of dendritic spines after cholinergic stimulation. Remodelling of spines is a key feature of excitatory synapses, which in conjunction with receptor trafficking modifies the efficacy of neurotransmission. Cholinergic activity has important functions in modulating synaptic plasticity that may also be reflected in changes of dendritic spine structure. Using confocal time-lapse microscopy in organotypic slice cultures, we found that brief activation of muscarinic receptors induced the emergence of fine filopodia from spine heads in all CA1 pyramidal cells examined. This response was widespread occurring in 48% of imaged spines, appeared within minutes, was reversible, and was blocked by atropine. Electron microscopic analyses showed that the spine head filopodia extend along the presynaptic bouton but were absent of postsynaptic densities, suggesting that they are not involved in the formation of new synaptic contacts. Instead, structural spine head modifications affected synaptic transmission indicated by a longer decay time of miniature EPSCs. Both morphological and electrophysiological changes were reduced by preventing microtubule polymerisation with nocodazole. The extension of spine head filopodia during cholinergic receptor activation represents a novel structural form of spine plasticity that may promote microtubule invasion in spines and regulate synaptic properties by fine-tuning interactions between presynaptic boutons and dendritic spines.

Es wurde gezeigt dass die synaptisch sekretierte Serinprotease Neurotrypsin von Bedeutung für höhere kognitive Funktionen ist, da ihre Störung zu schwerwiegende geistige Behinderung führt. Das extrazelluläre Matrixprotein Agrin ist gegenwärtig das einzig identifizierte Substrat von Neurotrypsin. Proteolytisches Schneiden von transmembranem Agrin bewirkt die Abspaltung von zwei Fragmenten vom N-terminalen Teil des Moleküls. Das freigesetzte C-terminale agrin-22 Fragment fördert die Entstehung von dendritischen Filopodien und trägt daher zur strukturellen Plastizität innerhalb des Gehirns bei. In der vorliegenden Doktorarbeit untersuche ich potenzielle Funktionen von N-terminalem Agrin, das auch nach Prozessierung weiterhin mit der Plasmamembran verbunden bleibt. Mikroskopische und biochemische Analysen identifizierten drei Regionen innerhalb des Agrinmoleküls, welche in der Lage sind Neurotrypsin zu binden. Zwei dieser Regionen besitzen Glykosaminoglykanketten und befinden sich im N- terminalen Abschnitt von Agrin. Die dritte Bindungsstelle befindet in der C-terminal gelegenen LG2 Domäne und beinhaltet eine Heparinbindungsstelle. Die Interaktion zwischen Neurotrypsin und den Glykosaminoglykanketten verstärkt die proteolytische Prozessierung von Agrin und lässt auf einen zusätzlichen regulatorischen Einfluss auf die Protease schliessen. N-terminales Agrin beinhaltet sieben Follistatindomänen, welche eine hohe Affinität zu mehreren Mitgliedern der TGF-β Superfamilie aufweisen. Drei dieser Cytokinine wurden in dissoziierten Neuronenkulturen auf mögliche Auswirkungen auf die Synaptogenese hin überprüft. Dafür entwickelte ich eine neuartige Synapsenquantifizierungsmethode, die eine automatische Verarbeitung von grossen Datensätzen ermöglicht. Zuletzt untersuchte ich das weitere Schicksal von N-terminalem Agrin nach Prozessierung durch Neurotrypsin. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich morphologische Veränderungen von dendritischen Spines nach cholinerger Stimulierung. Die Umstrukturierung von dendritischen Spines ist eine grundlegende Eigenschaft von exzitatorischen Synapsen, welche im Zusammenspiel mit gezieltem Rezeptorentransport, die Effizienz der neuronalen Übertragung reguliert. Cholinerge Aktivität hat bedeutenden Einfluss auf die Modulation der synaptischen Plastizität, was sich in einer Veränderung der dendritischen Struktur äussern könnte. Mit Hilfe von konfokaler Zeitraffermikroskopie untersuchten wir organotypische Gewebekulturen. Nach kurzer Stimulierung muskarinerger Rezeptoren beobachteten wir die Entstehung von Filopodien (dünnen Fortsätzen), die von den Spineköpfchen ausgingen und in allen CA1 Pyramidalzellen gefunden wurden. Der Effekt wurde in 48% aller Spines beobachtet, zeigte sich innerhalb von Minuten, war reversibel und konnte durch Atropin blockiert werden. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten, dass die „Spine Head Filopodien“ entlang der präsynaptischen Boutons verlaufen und frei von postsynaptischer Dichte waren, was darauf hindeutete, dass sie nicht in die Entstehung neuer synaptischer Kontakte involviert sind. Jedoch hatten die strukturelle Veränderungen der Spines einen Einfluss auf die synaptische Übertragung, da wir eine Verlängerung der „decay tau“ von Miniatur-EPSCs beobachteten. Sowohl morphologische als auch elektrophysiologische Veränderungen waren reduziert, sobald die Polymerisation von Mikrotubuli durch Zugabe von Nocodazole verhindert wurde. Die Entstehung von „Spine Head Filopodien“ durch Stimulierung cholinerger Rezeptoren stellt eine neuartige Form der Spineplastizität dar. Diese könnte die Spineinvasion von Mikrotubuli fördern und zur Feinregulierung der Interaktion zwischen präsynaptischen Boutons und dendritischen Spines beitragen.