Abstract
Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection causes a life-long chronic disease despite the tremendous success of combination antiretroviral therapy (cART). This is due to the ability of HIV-1 to persist in latent forms in long-lived infected cells. Currently approved antiretroviral drugs target multiple steps in the viral life cycle. Thus, latent cellular reservoirs of HIV-1 remain untouched and represent one of the major obstacles towards the goal of curing HIV-1 infection. The mechanisms of induction and maintenance of HIV-1 latency have not been fully resolved so far. Besides regulation by transcription factors and/or epigenetic modulation of the proviral DNA, one hypothesis suggests that HIV-1 latency may be mediated by the intracellular machinery governing innate antiviral defences, such as RNA-interference. This mechanism is mediated by small noncoding RNAs, which bind to complementary mRNA and finally lead to cleavage of the mRNA or suppression of translation. HIV-1 latency could be induced by targeting viral or cellular RNA necessary for viral replication.
Chapter 1 describes the establishment of a method to measure viral RNAs with single copy sensitivity. Quantitative PCR (qPCR) using fluorescent hydrolysis probes (FH-probes) of variable HIV-1 genomes can result in underestimation of viral copy numbers due to mismatches in the FH-probe’s target sequences. Particularly for detection of viral RNA in patients, successfully treated with cART, or in latently infected cells, highly sensitive qPCRs are essential. The study resulted in empirically validated novel principles of FH-probe design regarding conservation and qPCR performance. Several FH-probes used to quantify HIV-1 DNA over 6 orders of magnitude approached single copy sensitivity. Moreover, application of an algorithm to scan sequence databases for FH-probes with optimal phylogenetic conservation, allowed to identify functional FH-probes in various regions of the HIV-1 genome approaching coverage of the global HIV-1 pandemic.
The second chapter illustrates the development of a method to efficiently select and sequence small noncoding RNAs (sncRNAs), the key molecules of RNA interference. Since HIV-1 encoded sncRNAs represent only a small minority of sncRNAs in an infected cell, their detection remains difficult and reported frequencies of HIV-1 sncRNAs are usually <0.5%, if at all. Our approach was to enrich sequences homologous to HIV-1 by hybridization capture using HIV-1 ssDNA hybridization probes attached to Streptavidin beads. With this optimized selection method we were able to enrich low abundant HIV-1 sncRNAs more than 100-fold, i.e., >70% of captured sncRNAs were derived from HIV-1. This method was further applied to characterize the scope of viral sncRNA expression in primary HIV-1 infected cells. A multitude of HIV-1 sncRNAs was identified, distributed throughout the HIV-1 genome, yet, they clustered in contigs with hot-spots at distinct sites. Furthermore, hybrids of sense and antisense sncRNAs of one contig inhibit HIV-1 replication in primary macrophages demonstrating one possible function of these sncRNAs.
The third section refers to a study published in collaboration with colleagues from our research group. The study focused on monitoring HIV-1 RNA transcription patterns in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) during cART in acutely HIV-1 infected patients to assess the effect of early treatment on cellular viral reservoirs (Schmid et al., 2010). I developed the appropriate qPCR protocols (please compare first chapter), assisted with the search for optimal patient matched primers and FH- probes for highly sensitive qPCRs, supervised the qPCR procedures, and helped in analyzing and interpreting the qPCR data. This study showed that early cART in acute HIV-1 infection significantly depleted the number of transcriptionally active proviruses when compared to levels detected in patients starting ART during chronic HIV-1 infection. Therefore, future studies aiming at HIV-1 eradication should be initiated in patients during acute infection.
In conclusion, my thesis mainly focused on the establishment of highly sensitive and improved methods for the detection of HIV-1 genomes and HIV-1 derived small noncoding RNAs, respectively, to enable detailed studies of various aspects of HIV-1 latency. Thus, quantitative PCR protocols were developed to detect a broad range of highly diverse HIV-1 variants with single copy sensitivity, and a novel approach for very efficient enrichment of low abundant HIV-1 sncRNAs was established. Both methods lay the foundation for further studies, not only in the field of HIV-1, but also in other research areas where highly sensitive methods for the detection of RNA and sncRNAs are needed.
Zusammenfassung
Eine Infektion durch das Humane Immunodefizienz-Virus vom Typ 1 (HIV-1) verursacht eine lebenslange chronische Erkrankung, trotz einer sehr erfolgreichen kombinierten antiretrovirale Therapie (engl. cART). Ein wesentlicher Grund ist die Fähigkeit von HIV-1 in eine Latenzphase einzutreten und sich somit für das Immunsystem unsichtbar zu machen. Die mit HIV-1 latent infizierten Zellen können Jahre, wenn nicht Jahrzehnte überleben, ehe sie in die produktive Phase übergehen. Die heute zugelassenen antiretroviralen Medikamente greifen an verschiedensten Stellen in den viralen Lebenzyklus ein. Das latente zelluläre Reservoir von HIV-1 bleibt jedoch bis zum heutigen Tage unangetastet und repräsentiert eines der grössten Hindernisse auf dem Weg zur Heilung einer HIV-1 Infektion. Die Mechanismen der Induktion und Erhaltung der HIV-1 Latenz wurden bis heute noch nicht vollständig gelöst. Neben einer Regulierung durch Transkriptionsfaktoren und/oder epigenetische Modulationen der proviralen DNA, besagt eine dritte Hypothese, dass die HIV-1 Latenz durch intrazelluläre Mechanismen, welche für die angeborene antivirale Abwehr zuständig sind, verursacht werden könnte. Ein Beispiel für eine solche angeborene antivirale Abwehr ist die RNA Interferenz. Dieser Prozess wird durch kleine nicht-kodierende RNAs gesteuert, welche sich an komplementäre mRNAs binden und schlussendlich zu einer Zerteilung dieser mRNAs oder einer Unterdrückung der Translation führen. HIV-1 Latenz könnte daher durch eine gezielte Degradation von viraler oder zellulärer RNA, welche notwendig für die virale Replikation sind, verursacht werden.
Kapitel 1 beschreibt die Einführung einer Methode um virale RNAs mit der Sensitivität einer einzelnen Kopie messen zu können. Die quantitative PCR (qPCR) variabler HIV-1 Genome mit FH-Proben (engl. fluorescent hydrolysis probes) kann, im Falle einer Diskrepanz mit der Ziel-Sequenz der FH-Probe, zu einer Unterschätzung der viralen Kopienzahl führen. Besonders beim Nachweis viraler RNA in erfolgreich mit ART behandelter Patienten, oder in latent infizierten Zellen, sind höchst sensitive qPCRs entscheidend. Aus der Studie ergaben sich empirisch bestätigte neue Prinzipien - bezüglich Konservierung und qPCR Effizienz - zur Gestaltung von FH-Proben. Bei mehreren FH-Proben, welche zur Quantifizierung von HIV-1 DNA über 6 Grössenordungen angewendet wurden, lag die Sensitivität bei einer Kopie. Zusätzlich ermöglichte der Gebrauch eines Algorithmus die Durchsuchung von Sequenz Datenbanken nach FH-Proben mit optimaler phylogenetischer Konservierung. Dies ermöglichte die Identifizierung von funktionellen FH-Proben an verschiedenen Stellen des HIV-1 Genoms, welche annähernd die globale HIV-1 Pandemie abdecken.
Das zweite Kapitel illustriert die Entwicklung einer effizienten Methode um kleine nicht-kodierende RNAs (engl. sncRNAs) zu selektionieren und sequenzieren, welche die Schlüsselmolekule der RNA Interferenz darstellen. Da HIV-1 kodierte sncRNAs nur eine kleine Minderheit der sncRNAs einer infizierten Zelle darstellen, bleibt der Nachweis schwierig, und die Häufigkeit dieser HIV-1 sncRNAs wird normalerweise als <0.5%, wenn überhaupt vorkommend, beschrieben. Unser Ansatz war HIV-1 homologe sncRNAs durch Hybridisierung mit HIV-1 DNA Hybridisierungs-Proben anzureichern. Mit dieser optimierten Methode war es uns möglich die selten vorkommenden HIV-1 sncRNAs mehr als 100-fach anzureichern, das heisst >70% der selektionierten sncRNAs stammten von HIV-1. Diese Methode wurde auch angewendet um die Bandbreite der viralen sncRNA Expression in primären HIV-1 infizierten Zellen zu charakterisieren. Eine Vielzahl von HIV-1 sncRNAs wurde identifiziert, welche auf dem ganzen HIV-1 Genom verteilt sind, und doch in gewissen Contigs in spezifischen Regionen gehäuft anzutreffen sind. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Hybride von sncRNAs mit positiver und negativer Polarität die HIV-1 Replikation in primären Makrophagen inhibieren, was eine mögliche Funktion dieser sncRNAs darstellen könnte.
Der dritte Teil bezieht sich auf eine Studie, die ich in Zusammenarbeit mit Kollegen von unserer Forschungsgruppe durchgeführt habe. Die Studie hatte die Aufzeichnung der HIV-1 RNA Transkriptions Muster in peripheren mononukleären Blutzellen (engl. PBMC) zum Fokus. Diese wurden während der medikamentösen Behandlung von akut HIV-1 infizierten Patienten gemessen, um den Effekt der frühen Behandlung auf das virale Reservoir abzuschätzen (Schmid et al., 2010). Meine Beträge waren das Erstellen der qPCR Protokolle (im ersten Kapitel beschrieben), die Assistenz bei der Suche nach optimal an die viralen Sequenzen der Patienten angepassten Primern und FH-Proben, sowie die Mithilfe bei der Analyse und Interpretation der Resultate der qPCRs. Die Studie konnte zeigen, dass frühe ART während der akuten HIV-1 Infektion die Anzahl der transkriptionell aktiven Proviren signifikant senkt, verglichen mit Patienten, die die Behandlung erst während der chronischen Phase begannen. Daher sollten zukünftige Studie, welche die Eradikation von HIV-1 zum Ziel haben, bei Patienten während der akuten Phase initiiert werden.
Zusammenfassend war meine Arbeit fokussiert auf die Etablierung von sehr sensitiven und optimierten Methoden zum Nachweis von HIV-1 Genomen und kleinen nicht-kodierenden von HIV-1 stammenden RNAs, um detaillierte Studien zu verschiedenen Aspekten der HIV-1 Latenz durchführen zu können. Daher wurden quantitative PCR Protokolle entwickelt, um ein möglichst breites Spektrum stark unterschiedlicher HIV-1 Varianten mit grosser Sensitivität nachzuweisen. Auch wurde ein neuer Ansatz für eine sehr effiziente Anreicherung von selten vorkommenden HIV-1 sncRNAs gefunden. Beide Methoden legen die Grundlage für zukünftige Studien nicht nur im Feld von HIV-1, sondern auch in anderen Forschungsgebieten, in welchen hoch sensitive Methoden zum Nachweis von RNA und sncRNAs gebraucht werden.
Althaus, Claudia