Abstract
Flavonoids are a diverse group of plant secondary metabolites that accumulate in a variety of plant tissues and play many roles in important processes including stress protection, defence and seed dispersal. To accomplish many of these functions, flavonoids accumulate at high concentrations. However, the denaturing properties of these phenolic substances make them toxic to the cytosol. Therefore, flavonoids undergo secretion into the extracellular space or accumulate in the vacuole. The knowledge of transport mechanisms involved in the accumulation of flavonoids is limited, even though the biosynthetic pathway is well known. Recent reports suggest that MATE proteins are involved in flavonoid transport and act as cation H+/Na+-antiporters. However, the identification of conserved amino acid residues or domains essential to a transport function remains poorly characterised, with no reports for plant MATEs. TT12 is a vacuolar flavonoid/H+-antiporter expressed exclusively in the seed coat endothelium actively involved in the transport of glucosylated anthocyanins (Marinova et al, 2007). In this work we describe strategies to (i) functionally identify important amino acid residues using TT12 as a model for plant MATE family, (ii) functionally characterise two novel MATE transporters in Lupinus albus implicated in citrate and isoflavonoids transport and (iii) identify novel flavonoid transporters within the 56 members of the Arabidopsis MATE family. Since TT12 gene was well characterised in our laboratory and due to its easily scorable seed phenotype, we decided to use TT12 as a model to investigate which amino acids are crucial for proper functioning of plant MATE transporters. Given that transport critical residues for NorM from Vibrio parahaemolyticus and hMATE1 from Homo sapiens were identified and we found an amino acid residue homologous to them in TT12 (E290), we performed site-directed mutagenesis on E290 and nine others amino acid residues. In the range of experiments we searched specially for the mutated versions of TT12 which were unable to functionally complement the PA deficient seed phenotype of tt12 mutant. We describe that only a single amino acid (E290) failed to complement the tt12 seed phenotype and further show that this mutated version completely lacks transport activity on cyanidin 3-glucoside (the substrate for the native TT12). White lupins characteristically produce cluster roots under phosphate starvation. These cluster roots are known to excrete both citrate and isoflavonoids into the rhizosphere. Previous work within the group identified two full-length cDNAs expressed in cluster roots. These were designated LaMATE1 and -2. We investigated if these cDNAs, when heterogously expressed in yeast, were able to transport either citrate or the isoflavonoid, genistein. We describe that LaMATE1 was unable to transport citrate but LaMATE2 transported genistein, when uptake experiments were conducted with microsomes. Using previously published data and in silico sequence analyses, we selected three candidate genes for novel flavonoid transporters. AtDTX35 (At4g25640) has been reported to be homologous to a tomato MATE which is upregulated in the tomato mutant, ANT1 encoding proteins involved in the anthocyanin biosynthesis (Mathews et al, 2003). We started our approach with downregulation of DTX35 gene with RNAi in PAP1 overexpressing line, which due to hyperaccumulation of anthocyanin exhibits purple pigmentation. Interestingly, numerous lines carrying the RNAi construct reverted from purple color to green. We describe that DTX35 was unable to complement tt12 seed phenotype and its promoter tissue activity is not specific in young seedlings. AtDTX31 (At1g12950) has been shown to be transcriptionally upregulated in Arabidopsis roots under salt treatment and displayed a similarity to proteins predominantly expressed in tomato fruits (Maathuis, 2006). To investigate if DTX31 is expressed in salt stress conditions, we performed sqPCR analyses and examined if DTX31 promoter activity is also tissue-specific. We describe that DTX31 is highly expressed in the roots of Arabidopsis subjected to salt stress and its promoter’s spatial activity in response to high concentration of salt. AtDTX28 (At5g44050) has been reported to be induced after UV-B treatment, which is a main reason for increase in the transcript abundance of genes, including MYB12 (the transcription factor) which are involved in the flavonol biosynthesis. We investigated if DTX28 expression in MYB12 overexpressing line, myb12 knock-out line and triple knock-out line myb11- myb12-myb111 is different in comparison to the wild-type line by sqPCR and HPLC analyses. We describe that DTX28 does not show higher transcript level in MYB12 overexpressing lines compared to the wild-type and no differences were observed in metabolic profiles between mutants and a wild-type.
ZUSAMMENFASSUNG
Flavonoide sind Sekundärmetabolite die zur Klasse der phenolischen Substanzen gehören. Sie werden in den meisten Pflanzengeweben akkumuliert und spielen bei der Reaktion der Pflanze gegen Stresssituationen und Pflanzenpathogene sowie bei der Verbreitung von Samen eine wichtige Rolle. Um diese Funktionen auszuüben, werden Flavonoide in hohen Konzentrationen synthetisiert und akkumuliert. Da Phenole aber potentiell toxisch sind, dürfen sie nicht im Cytosol vorliegen. Deshalb werden Flavonoide entweder in den Apoplasten exkretiert oder in der Vakuole gelagert. Unser Wissen über die Transportmechanismen, die zu einer vakuolären Akkumulation der Flavonoide führen, sind immer noch limitiert obwohl deren Biosynthese sehr gut aufgeklärt ist. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass MATE Proteine am Flavonoidtransport beteiligt sind und als Kationen (H + oder Na+)/Flavonoid Antiporter wirken. Unser Wissen, welche MATE Proteine tatsächlich am Flavonoidtransport beteiligt sind ist aber noch sehr gering. Hinzu kommt, dass auch noch sehr wenig darüber bekannt ist, welche konservierten Aminosäuren oder Domänen für die Transportfunktion wichtig sind; speziell für pflanzliche MATEs ist dahingehend bisher noch nichts beschrieben. TT12 ist ein vakuolärer Flavonoid/H+ Antiporter, der ausschliesslich im Endothel der Samenschale exprimiert wird und glukosilierte Anthocyane transportiert (Marinova et al 2007). In der vorliegenden Arbeiten werden Strategien beschrieben, um (i) anhand von TT12 Aminosäuren zu identifizieren, die für die Funktion von MATEs wichtig sind, zwei MATEs von Lupinus albus zu charakterisieren und innerhalb der Klasse der MATEs von Arabidopsis, die 56 Mitglieder enthält, neue Flavonoidtransporter zu identifizieren. Da TT12 in unserem Labor gut charakterisiert wurde und da ein Phänotyp leicht erkennbar ist (proanthcyanidinedefizient), haben wir uns entschlossen TT12 als Model zu verwenden um herauszufinden, welche Aminosäuren für die korrekte Funktion von pflanzlichen MATEs wichtig sind. Da für die zwei MATEs NorM (Vibrio parahaemolyticus) und hMATE1 (Homo sapiens) gezeigt wurde, das eine bestimmte Aminosäure, die auch in TT12 konserviert ist (E290), für die Funktion eine entscheidende Rolle spielt, haben wir diese und neun weitere Aminosäuren mutagenisiert. Nachdem die mutierten Formen in die tt12 Mutante eingeführt wurden haben wir die Samen mit den mutierten TT12 Versionen danach untersucht, ob die mutierte Version den Phänotypen nicht mehr komplementieren kann. Wir haben gesehen, dass nur die E290 Mutation den Phänotypen ganz und gar nicht mehr komplementieren konnte und konnten mit Transportmessungen auch zeigen, dass diese Version Cyanidin 3-Glukosid (das Substrat von TT12) nicht mehr transportieren kann. (ii) Weisslupine produziert unter phosphatlimitierenden Bedingungen charakteristische Clusterwurzeln. Es wurde beschrieben, dass diese Wurzeln Citrat und Isoflavonoide in die Rhizosphäre exkretieren. In einer vorangegangenen Arbeit in unserem Labor wurden zwei Volllänge cDNAs von MATE Proteinen aus Clusterwurzeln identifiziert, LaMATE1 und -2. Wir haben untersucht, ob diese MATEs, wenn sie heterolog in Hefe exprimiert werden, entweder Citrat oder das Isoflavonoid Genistein transportieren können. Wir haben gesehen, dass LaMATE1 kein Citrat transportiert, aber LaMATE2 in isolierten Hefemikrosomen den Transport von Genistein katalysiert. Um potentielle Kandidaten für den Flavonoidtransport in Arabidopsis zu identifizieren, haben wir uns auf publizierte Arbeiten bezogen und in silico Analysen durchgeführt. Wir haben drei Kandidaten für eine vertiefte Analyse ausgewählt, mit dem Ziel weitere im Flavonoidtransport involvierte MATEs zu identifizieren. AtDTX35 (At4g25640) ist homolog zu einem Tomaten MATE Protein, beschrieben worden, das in einer Tomatenmutante hochreguliert ist, die den Transkriptionfaktor ANT1, der für die Anthocyanbiosynthese verantwortlich ist, überexprimiert (Mathews et al, 2003). Um herauszufinden, ob DTX35 an der Akkumulation von Anthocyanen beteiligt ist, haben wir DTX35 unter der Kontrolle des Banylus Promoters in der tt12 Mutante exprimiert und GUS Analysen durchgeführt, um in silico Daten zu validieren. Wir haben gesehen, dass DTX35 den Samenphänotyp von tt12 nicht komplementieren kann und der Promotor in jungen Pflanzen überall aktiv ist. AtDTX31 (At1g12950) wird in Wurzeln von Arabidopsis durch Salzstress induziert und zeigt eine Ähnlichkeit zu Proteinen, die in reifenden Tomaten stark exprimiert werden (Maathuis, 2006). Um zu bestätigen, dass AtDTX31 induziert wird, haben wir sqPCR Analysen mit Blatt- und Wurzelproben durchgeführt und die Promotoraktivität in transgenen Arabidopsis Planzen analysiert, die ein DTX31-Promotor-Glucuronidase Konstrukt exprimieren. Wir können zeigen, dass DTX31 ein vakuolärer MATE ist, der unter Salzstress stark in Arabidopsiswurzeln exprimiert wird. Zusätzlich zeigen erste Experimente, dass in der entsprechenden Mutante die Wurzelexkretion verändert ist. AtDTX28 (At5g44050) wurde als Gen beschrieben, das durch UV-B induzierbar ist, einem Stress, der bekanntermassen Gene induziert, die an der Favonolbiosynthese beteiligt sind, wie z.B. den Transkriptionsfaktor MYB12. Wir haben untersucht ob die Expression von DTX28 in Arabidopsispflanzen verändert ist, die MYB12 überexprimieren, die kein funktionelles MYB12 mehr besitzen und bei denen drei MYBs, MYB11, MYB12 und MYB111, fehlen. Weitere Analysen beinhalteten HPLC Analysen um zu sehen, ob die Akkumulation von Flavonoiden in der dtx28 Mutante verändert waren. Unsere Resultate zeigen, dass DTX28 kein verändertes Expressionsmuster in den verschiedenen Mutanten zeigt und dass das Flavonoidmuster nicht von demjenigen der Wildtyp Pflanzen abweicht.
Polinceusz, Anna Izabela