Abstract
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer in childhood and occurs in the bone marrow and blood. Patients can be effectively cured with combinatorial chemotherapy in 80% of cases, but the high toxicity of the treatment and the frequency of relapses still are major obstacles and lead to high mortality. Based on current treatment protocols of one of the biggest study groups on childhood ALL, the BFM study group (named after Berlin-Frankfurt-Münster, to credit the founding members), a group of patients can be identified with particular bad outcome. The prognosis is given based on the measurement of minimal residual disease (MRD). This group of very high-risk patients (VHR-ALL) is in need of novel treatment approaches. Due to the scarcity of primary material and the lack of in vitro models to study ALL biology we have established a xenograft model of VHR-ALL with the aim to model high-risk disease. Therefore, it is necessary to understand the effects of the selective pressures that are inherent to the xenograft model. Clonal evolution of the leukemogenic compartment could contribute to alter the response to chemotherapy in ALL. Thus, we have investigated the phenotypic and genetic composition of VHR- ALL cases before and after xenotransplantation. We found that the phenotypic properties remained unchanged, with concordant immunophenotypes after up to 5 passages in NOD/scidIL2Rγnull (NSG) mice and stable in vitro drug response profiles. Analysis of copy number alterations (CNA) showed that the xenografted leukemia, even when reconstituted from hundred ALL cells, remained highly related to the diagnostic sample, with minor changes in CNAs, emerging in most cases in the first passage into mice and occurring in recurrently detected loci in ALL. At the single-cell level, the pattern of mono-and bi-allelic deletions of the CDKN2A locus revealed distinct leukemia subpopulations, which were reproducibly tracked in xenografts. Only in one case, the major clone of xenografts was different to diagnosis but could be backtracked. In most VHR-ALL cases, the predominant diagnostic clones were reconstituted in xenografts, as shown by multiplex PCR analysis of Ig/TCR loci. In other cases, the pattern in CNAs and Ig/TCR rearrangement was less concordant in xenografts, suggesting the outgrowth of subclones. In four of six VHR-ALL cases, the relative low number of 100 unsorted cells was enough to propagate leukemia in NSG mice and the resulting leukemias resembled in phenotype, genotype and clonal composition the diagnostic sample in the same way as leukemias generated from more cells. Thus, we have demonstrated the multiclonal composition of leukemia-propagating cells in VHR-ALL samples, making it likely that if here is a hierarchy in VHR-ALL it is a flat one Our xenograft model was successfully used as a preclinical model to evaluate new treatment rationales for chemosensitization for VHR-ALL patients. We proved that the small molecule obatoclax could effectively re-sensitize to chemotherapy in the xenograft model. This approach will be translated into a Phase-1 clinical trial. We also exploited the xenograft system as a renewable source of relevant patient material and thereby could contribute to the understanding of the importance of CRLF2 in the context of Down-Syndrome ALL. Taken together, we have established a xenograft model of VHR-ALL that enables to perform functional studies with relevant samples. It is likely that a larger proportion of ALL cells are leukemogenic and the nature of ALL cells is oligo- or even polyclonal, providing the basis for clonal selection and escape of treatment. Consequentially, future treatment approaches need to consider the full diversity of ALL and targeting of all subpopulations must be reached.
Die häufigste Krebsart bei Kindern ist die akute lymphatische Leukämie (ALL), eine Erkrankung des Blutes und Knochenmarkes. 80% der Patienten können durch eine Kombinationstherapie geheilt werden. Dabei führen die hohe Toxizität der Behandlung und die häufigen Rezidive jedoch zu einer hohen Mortalitätsrate. Aufgrund von den derzeitigen Protokollen einer der grössten Studiengruppen der pädiatrischen ALL, der BFM-Studiengruppe (benannt nach den Gründungszentren in Berlin-Frankfurt-Münster), können Patienten mit einer ausgesprochen schlechten Prognose identifiziert werden. Die Prognose wird anhand der Messung der minimalen Resterkrankung (MRD) erstellt. Diese Patienten mit Hochrisiko-ALL (VHR- ALL) brauchen neue Therapieansätze. Eine präklinische experimentelle Plattform ist wünschenswert, da diagnostisches Material sehr rar ist und es an in vitro Methoden zur Erforschung der ALL mangelt. Wir haben daher ein Xenograft-Modell der VHR-ALL etabliert. Um das Modell zur präklinischen Forschung zu nutzen, ist es notwendig den selektiven Druck genau zu charakterisieren, der durch das Xenograft auf die ALL Zellen wirkt. Die klonale Evolution der Leukämie erzeugenden Subpopulationen könnte das Ansprechen auf die Chemotherapie verändern. Daher haben wir die phänotypische und genetische Zusammensetzung der ALL vor und nach der Xenotransplantation in NOD/scidIL2Rγnull (NSG) Mäusen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die phänotypischen Eigenschaften unverändert blieben. Im Einzelnen waren die Immunphänotypen und die in vitro Toxizitätsprofile bis zu fünf Passagen lang stabil. Die Analyse von Copy Number Abweichungen (CNA) der DNS zeigte, dass Xenograft-Proben den diagnostischen Proben sehr ähnlich waren, sogar wenn nur 100 Zellen zur Transplantation des Xenografts benutzt wurden. Kleinere Veränderungen traten meistens schon in der ersten Passage auf. Und zwar in solchen Genen, die in der Leukämie schon zuvor als veränderlich bekannt waren. Auf Einzelzellebene wurden mono- und bi-allelische Deletionen des Gens CDKN2A angeschaut. Dabei zeigte sich, dass es verschiedene leukämische Subpopulationen gibt. Diese wurden reproduzierbar in mehreren Xenograft Proben detektiert. Nur in einem Fall war der vorherrschende Klon zwischen Diagnose und Xenograft unterschiedlich, konnte jedoch zurückverfolgt werden. In den meisten VHR-ALL Fällen wurden die in der Probe der Diagnose vorherrschenden Klone auch in den Xenograft-Proben nachvollzogen, wie wir mittels PCR Analyse der Ig/TCR-Loci feststellen konnten. In seltenen Fällen war das Muster der CNAs und Ig/TCR Rearrangements weniger konserviert, was auf eine Selektion von Subpopulationen schliessen lässt. In vier von sechs VHR-ALL Fällen waren 100 unsortierte Zellen ausreichend, um eine Leukämie in den NSG Mäusen zu erzeugen. Die daraus resultierenden Leukämien ähnelten in Phänotyp und Genotyp den diagnostischen Proben genauso stark wie Leukämien, die mit mehr Zellen erzeugt wurden. So konnten wir zeigen, dass die Leukämie erzeugenden Zellen von Hochrisiko Patienten eine multiklonale Zusammensetzung haben und dass diese Zusammensetzung während der Xenotransplantation in NSG Mäuse stabil erhalten bleibt. Unser Xenograft Modell wurde als präklinisches Modell zur Evaluierung neuer Behandlungsprinzipien zur Chemosensibilisierung von resistenten Patienten erfolgreich angewandt. Wir konnten im Xenograft Modell zeigen, dass das kleine Molekül Obatoclax zur effektiven Resensibilisierung gegenüber der Chemotherapie geführt hat. Dieser Ansatz wird demnächst in einer klinischen Phase 1 Studie umgesetzt werden. Ausserdem nutzten wir das Xenograft Modell als erneuerbare Quelle für das seltene diagnostische Material und konnten so zu einer Studie über die Bedeutung von CRLF2 im Zusammenhang mit Leukämien von Down-Syndrom Patienten beitragen. Zusammengefasst haben wir ein Xenograft Modell der VHR-ALL etabliert, welches funktionale Studien mit relevanten Fällen ermöglicht. Da es wahrscheinlich ist, dass ein Grossteil der ALL-Zellen Leukämien induzieren kann und sie oligo- oder sogar polyklonal sind, ist anzunehmen, dass dies der Grund ist, weshalb es zur klonalen Selektion kommt und ein Entrinnen von der Therapie möglich ist. Neue Therapieansätze müssen daher konsequenterweise die Vielfalt der gesamten Leukämischen Population umfassen.
Schmitz, Maike