Abstract
Broadening the understanding of mechanisms linked to innate immunity is of primordial importance in a time of continuous emergence of rapidly spreading viral diseases. The domestic cat represents an ideal model for the study of host-virus interactions, as it is an outbred species naturally susceptible to many viruses sharing biological properties with those affecting humans. Additionally, due to their acquisition of infallible transmission strategies, rapid propagation of feline viruses within a group is particularly difficult to inhibit, reflecting the challenges linked to the prevention of pandemics. The present work was designed to gain insights on the innate immune responses of the domestic cat to viruses, and to determine whether early antiviral mechanisms can be manipulated to enhance resistance to viral infection in this species. In a first phase, real-time polymerase chain reaction (PCR) systems were developed, enabling to measure the expression of feline genes considered to be hallmarks of innate responses to viral infection, including various interferon (IFN) α and IFNω subtypes, IFNβ, intracellular antiviral Myxovirus resistance (Mx) factor, natural killer (NK) cell stimulator IL-15 and effectors perforin and granzyme B, as well as Toll-like receptors (TLRs) 3, 7, 8 and 9. These tools could then be employed to evaluate innate immune parameters in both in vitro and in vivo models of infection, conferring valuable information not only regarding strength, breadth and kinetics of antiviral defences in feline cells, but also possible biological properties of important viruses affecting the cat. In a further step, the newly developed PCR assays were utilized to assess the immunomodulatory potential of various immune response modifiers (IRMs) in feline cells in vitro. The IRMs mimicking natural viral components were selected, namely Poly IC and Resiquimod (R-848), artificial models of viral dsRNA and ssRNA, as well as dSLIM™ and ODN 2216, synthetic oligonucleotides containing several unmethylated CpG motifs. Although all analysed IRMs positively modulated the innate immune state of treated peripheral mononuclear cells (PBMCs), ODN 2216 induced by far the most potent response: this molecule not only altered the gene expression profile of feline PBMCs in an antiviral orientation, but also significantly enhanced the proliferation of these immune cells and increased the presence on their surface of co-stimulatory molecules necessary for the diffusion of immunological defence signals. Moreover, when incubated in vitro with target cells of epithelial and fibroblastic origin, the supernatants of ODN 2216-stimulated PBMCs not only induced high production of intracellular antiviral proteins in these cells but also inhibited the replication of five feline viruses, namely the feline calici- (FCV), herpes- (FHV), parvo- (FPV), corona- (FCoV) and leukemia (FeLV) viruses. Altogether, this study procures a better understanding of innate antiviral mechanisms in an outbred species and highlights the promising potential of CpG-containing molecules such as ODN 2216 to protect domestic cats against a broad range of virus infections. Further in vitro and in vivo investigations will determine the feasibility of stimulation of the innate immune system by such molecules to prevent viral propagation in humans, cats and other species.
Infolge der immer häufigeren Ausbrüche noch unbekannter, sogenannter „emerging“ viralen Krankheiten, wird es heutzutage immer wichtiger, das Verständnis der Mechanismen des angeborenen Immunsystems zu verbessern. Für solchen Studien ist die Hauskatze ein ideales Modell, da sie ausgezüchtet und empfänglich für verschiedene Viren ist, die nahe verwandt sind mit denjenigen die auch Menschen betreffen. Aehnlich wie im Falle einer Pandemie ist die schnelle Ausbreitung viraler Infektionen in einer Gruppe von Katzen zudem schwierig zu verhindern, da feline Viren während der Evolution effiziente Uebertragungsstrategien entwickelt haben. Die Ziele der vorliegenden Arbeit umfassten das Erwerben neuer Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem der Katze und die Prüfung der Möglichkeit zur Induktion einer allgemeinen Resistenz gegen virale Infektionen in dieser Spezies durch die Stimulierung antiviraler Immunmechanismen. In einem ersten Schritt wurden real-time Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Systeme entwickelt, mit denen die Expression von felinen Genen gemessen werden können, die im Ablauf einer angeborenen Immunantwort gegen Virusinfektionen eine Rolle spielen. Dazu gehören verschiedene Interferon (IFN) α and IFNω Subtypen, IFNβ, der intrazelluläre antivirale Myxovirus Resistenz (Mx) Faktor, das (Natural Killer) NK Zell stimulierende Zytokin IL-15 sowie NK Effektorproteine Perforin and Granzyme B, und die Toll-like Rezeptoren (TLR) 3, 7, 8 und 9. In einer zweiten Phase wurden diese neuen Assays eingesetzt, um die angeborenen Immunparameter in Infektionsmodellen in vitro und in vivo zu evaluieren. Die Resultate lieferten wertvolle Angaben über die Stärke, Breite und Kinetik von antiviralen Abwehrmechanismen in felinen Zellen. Die weitere Anwendung der entwickelten PCR Systemen erlaubte das immunmodulierende Potential verschiedener sogenannten „immune response modifiers“ in vitro in Katzenzellen zu evaluieren. Es wurden IRMs ausgewählt, welche natürlichen viralen Komponenten ähnlich sind, nämlich Poly IC und Resiquimod (R-848), synthetische Varianten der viralen doppelsträngigen (ds) RNA and einzelsträngigen (ss) RNA, sowie dSLIM™ und ODN 2216, synthetische Oligonukleotide, die unmethylierten Cytosine-Phosphat-Guanosine (CpG) Motive beinhalten. Obwohl alle analysierten IRMs den Immunstatus von stimulierten peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) positiv beeinflussten, erwies sich ODN 2216 als der stärkste IRM: dieses Molekül induzierte nicht nur die Expression von antiviralen Effektorgenen in felinen PBMCs, sondern stimulierte auch die Proliferation dieser Immunzellen und erhöhte die Präsenz auf deren Oberfläche von costimulatorischen Molekülen, welche für die Verbreitung von antiviralen Signalen äusserst wichtig sind. Zudem induzierten Ueberstände, welche in vitro durch ODN 2216-stimulierte PBMCS produziert worden waren, die Produktion von intrazellulären antiviralen Mx Proteinen in Zielzellen aus epithelialem und fibroblastischem Ursprung, womit die Replikation von fünf felinen Viren markant gehemmt wurde. Bei den Viren handelt es sich um die felinen Calici- (FCV), Herpes- (FHV), Parvo- (FPV), Corona- (FCoV) und Leukaemie. (FeLV) Viren, die alle zu verschiedenen Familien gehören. Insgesamt vermittelt diese Studie ein besseres Verständnis der angeborenen antiviralen Mechanismen in einer ausgezüchteten Spezies und zeigt das vielversprechende Potenzial von CpG-enthaltenden Molekülen die Hauskatze gegen ein breites Spektrum von Virusinfektionen zu schützen. Mit weiteren in vitro und in vivo Untersuchungen sollte die Möglichkeit geprüft werden, die Uebertragung von Virusinfektionen in Menschen, Katzen, und anderen Spezies zu hemmen.
Robert-Tissot, Céline