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Molecular mechanisms controlling pluripotency in embryonic stem cells


Casanova, Elisa. Molecular mechanisms controlling pluripotency in embryonic stem cells. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary  



SUMMARY

The transition between morula and blastocyst stage during preimplantation development represents the first differentiation event of embryogenesis. Morula cells undergo the first cellular specialization and produce two well-defined populations of cells, the trophoblast and the inner cell mass (ICM). Embryonic stem cells (ESCs) with unlimited self-renewal capacity are believed to represent the in vitro counterpart of the ICM cells. A unique and complex signaling network allows embryonic stem cells (ESCs) to undergo extended proliferation in vitro, while maintaining their capacity for multilineage differentiation. Genuine ESC identity can only be maintained when both self-renewal and suppression of differentiation are active and balanced. Despite many efforts have been made in the past years, aimed at understanding the molecular factors driving and controlling pluripotency in vivo and in vitro, the precise mechanisms of how these processes are regulated remain largely unknown. Therefore, the overall goal of this thesis was to gain knowledge on the molecular mechanisms that control stemness in pluripotent stem cells. The work was divided into two different studies: the first was focused on the function of pluripotency related genes in ESCs and the second consisted in a genome wide expression analysis of mouse and rat preimplantation stage embryos.

The activation of the LIF/STAT3 signaling was shown to be sufficient to maintain ESCs in an undifferentiated and pluripotent state. Thus, in a first study the importance of STAT3 in the establishment of ESCs was investigated. In order to identify new STAT3 target genes, ESCs overexpressing STAT3 were derived from a non-permissive mouse strain and their expression profiles were compared with wild type ESCs. Several genes were detected as potential key-players involved in maintenance of pluripotency in ESCs. The function of two of these genes, Pramel6 and Pramel7, was extensively characterized. We identify Pramel7 (preferentially expressed antigen in melanoma-like 7) as a novel factor crucial for maintenance of pluripotency and LIF-mediated self-renewal in ESCs. In vivo, Pramel7 expression was exclusively found in the pluripotent pools of cells, namely, the central part of the morula and the inner cell mass of the blastocyst. Ablation of Pramel7 induced ESC differentiation, whereas its overexpression was sufficient to support long-term self-renewal in the absence of exogenous LIF. Furthermore, Pramel7 overexpression suppressed differentiation in ESCs in vitro and in vivo. This process was reversible, as on transgene excision cells reverted to a LIF- dependent state and regained their capacity to participate in the formation of chimeric mice. Molecularly, LIF directly controls Pramel7 expression, involving both STAT3-dependent transcriptional regulation and PI3K-dependent phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). Pramel7 expression in turn confers constitutive self-renewal and prevents differentiation through inactivation of extracellular signal-regulated kinase phosphorylation. Accordingly, knockdown of Pramel7 promotes ESC differentiation in presence of LIF and even on forced STAT3- activation. Thus, with this study we demonstrated that Pramel7 represents a central and essential factor in the signaling network regulating pluripotency and self-renewal in ESCs.

Rats represent an optimal animal model for the investigation of human diseases and in some research fields is often, due to its bigger size and higher genetic diversity, preferred to the mouse. Despite the benefits of working with rats, the impossibility of generating germ line competent rat ESCs has given the mouse a clear advantage over the rat in the generation of new transgenic models. All the efforts made for establishing authentic rat ESCs have failed in the last 30 years and only recently, by using defined culture conditions, genuine pluripotent rat ESCs have been established for the first time, from different strains. Although, both mouse and rat ESCs can be derived from the ICM cells, they differ in their in vitro stability. We aimed in our study at the identification of differences at the transcriptional level between the mouse and the rat during the developmental period in which the ICM cells are formed, since they represent the source of ESCs derivation. We performed a microarray analysis in which we compared Summary

the transcriptome of mouse and rat morula, blastocyst, and ICM. This is the first study investigating the gene expression changes during the transition from morula to blastocyst in the rat preimplantation development. Moreover, it represents a new example of statistical approach for cross species analysis, applicable also to other species comparisons, that allows to highlight the species-specific behaviour of genes within important pathways and families. In order to identify alternative regulation of important molecular mechanisms the investigation of differential gene expression between the two species was extended at the level of signaling pathways, gene families, and single selected genes of interest. This study reports for the first time that in the pluripotent pool of cells of the rat and mouse preimplantation embryo substantial differential regulation of genes is present, which might explain the difficulties observed for the derivation and culture of rat ESCs using murine conditions. Some of the genes differentially expressed are already known to be important factors in the maintenance of pluripotency in ESCs, like for example Sox2 or Stat3, or play a role in reprogramming somatic cells to pluripotency like c-Myc, Klf4 and p53 and would therefore represent interesting candidates to further analyze in vitro in the rat ESCs. The differential regulation of critical genes could represent the starting point for analyzing their function in vitro in mouse and rat ESCs. Furthermore, this knowledge could be critical for the improvement of the derivation and maintenance of rat ESCs. A broader knowledge on the molecular mechanisms that occur in rat ESCs would improve the efficiency of establishing stable authentic pluripotent rat ESCs and therefore it would facilitate the generation via gene targeting of transgenic rat models, which are indispensable for the biomedical research. Zusammenfassung  



ZUSAMMENFASSUNG

Das erste Differenzierungsereignis während der Embryonalentwicklung in der Präimplantationsphase ist der Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium. Dabei durchleben die Morulazellen die allererste zelluläre Spezifizierung, welche in zwei voneinander unterscheidbaren Zellpopulationen resultiert, dem Trophoblasten und der inneren Zellmasse (ICM). Es wird angenommen, dass embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mit ihrer Fähigkeit, sich unendlich erneuern zu können, das in vivo-Pendant zu den Zellen der inneren Zellmasse darstellen. Die Kultivierung und Proliferation von embryonalen Stammzellen in vitro wird durch einen einzigartigen und komplexen Signalverbund ermöglicht. Dieser hält die Zellen in einem pluripotenten Zustand, ohne dass diese die Eigenschaft verlieren, Gewebe aller drei Keimblätter bilden zu können. Dieser Zustand kann nur erreicht werden, wenn einerseits der Selbsterneuerungsmechanismus funktioniert und andererseits die Differenzierung in genügendem Masse unterdrückt wird, was bedeutet, dass eine bestimmte Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung gewährleistet sein muss. In den letzen Jahrzehnten wurde ein enormer Aufwand betrieben, um dem molekularen Geheimnis der Pluripotenzerhaltung in vitro und in vivo auf den Grund zu kommen. Trotzdem ist immer noch sehr unklar, wie die Mechanismen genau funktionieren. Das Gesamtziel dieser Studie war es deshalb, weiteres Wissen über die molekularen Prozesse, welche die Pluripotenzerhaltung kontrollieren, zu erlangen. Die Arbeit wurde anfänglich in zwei verschiedene Studien aufgeteilt: Die erste befasste sich mit der Funktion von Genen, welche mit Pluripotenz in Verbindung gebracht werden können, die zweite bestand in einer vergleichenden Genexpressionsanalyse von Maus- und Rattenembryonen während verschiedenen Präimplantationsstadien.

Es ist bekannt, dass die Aktivierung des LIF/STAT3 Signalwegs ausreicht, um ES-Zellen in einem undifferenzierten und pluripotenten Zustand zu erhalten. Deshalb untersuchten wir in einem ersten Ansatz die Wichtigkeit von STAT3 in der Etablierung von ES-Zellen. Um neue STAT3-Zielgene zu identifizieren, wurden STAT3-überexprimierende ES-Zellen aus einem nicht-permissiven Hintergrund etabliert, um später deren Expressionsprofil mit demjenigen von Wildtyp ES-Zellen zu vergleichen. Mehrere Gene zeigten eine veränderte Expression. Einige von ihnen wurden als potentielle Schlüsselfaktoren der Pluripotenzerhaltung in Betracht gezogen. Von Pramel6 und Pramel7, zwei dieser Kandidatengene, wurde die Funktion umfassend analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass Pramel7 (preferentially expressed antigen in melanoma-like 7) eine wichtige Rolle in der Erhaltung der Pluripotenz und in der vom LIF/STAT3 Signalweg vermittelten Selbsterneuerung von ES-Zellen einnimmt. Es zeigte sich weiter, dass Pramel7 in vivo exklusiv in vollumfänglich pluripotenten Zellen exprimiert wird, also im zentralen Zellkompartement des Morulastadiums und in der inneren Zellmasse der Blastozyste. In vitro wurde beobachtet, dass das Fehlen von Pramel7-Expression zur Differenzierung von ES-Zellen führt, dessen Überexpression hingegen zur Folge hatte, dass die Selbsterneuerung der Zellen ohne Zugabe von exogenem LIF über längere Zeit aufrecht erhalten werden konnte. Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von Pramel7 die Differenzierung von ES-Zellen in vitro und in vivo. Dieser Prozess ist umkehrbar: Nach der Entfernung des Pramel7- Transgens, welches die Überexpression verursachte, wurden die Zellen erneut LIF-abhängig und erlangten die Fähigkeit, Chimären zu bilden. Auf molekularer Ebene wird Pramel7 direkt durch LIF kontrolliert, einerseits via STAT3-abhängige Transkriptionsregulation, andererseits durch PI3K- abhängige Phosphorylierung der Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β). Pramel7-Expression wiederum gewährleistet konstitutive Selbsterneuerung und verhindert Differenzierung durch Inhibition der Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinase (ERK). Dementsprechend begünstigt der Knockdown von Pramel7 die Differenzierung von ES-Zellen, auch unter Zugabe von exogenem LIF und sogar nach erzwungener STAT3-Expression. Zusammenfassend wurde in dieser Studie gezeigt, dass Pramel7 eine zentrale und wichtige Rolle im pluripotenzerhaltenden Signalverbund der Selbsterneuerung von ES-Zellen darstellt.

Die Ratte ist ein optimales Modell für die Untersuchung von menschlichen Krankheiten. In einigen wissenschaftlichen Bereichen wird sie der Maus vorgezogen, hauptsächlich wegen dem grösseren Körper und der höheren genetischen Diversität. Trotz dieser Vorteile war es für lange Zeit nicht möglich, keimbahnkompetente ES-Zellen von Ratten zu generieren, was der Maus im Bereich der Herstellung von transgenen Modellen einen klaren Vorteil verschaffte. In den letzten 30 Jahren schlugen trotz grösster Anstrengungen alle Versuche fehl, authentische Ratten ES-Zellen zu generieren. Erst kürzlich gelang es einer Forschungsgruppe funktionelle ES-Zellen von verschiedenen Rattenstämmen unter definierten Kulturbedingungen zu derivieren. Obwohl nun ES-Zellen aus der inneren Zellmasse von Maus und Ratte hergestellt werden können, unterscheiden sich die Zelllinien der verschiedenen Spezies in ihrer Stabilität in vitro.

Die zweite Studie setzte sich zum Ziel, Unterschiede zwischen Maus und Ratte während der Transition vom Morula- zum Blastozystenstadium auf transkriptioneller Ebene aufzudecken, da die Zellen der inneren Zellmasse der Blastozysten das Ursprungsmaterial für die Generierung von ES- Zellen darstellen. Dafür wurde eine Microarrayanalyse durchgeführt, in welcher die Transkriptome von Morulae, Blastozysten und innerer Zellmassen der Maus und der Ratte verglichen wurden. Dies ist die erste Studie, welche die Veränderungen der Genexpression während dem Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium untersucht. Darüber hinaus repräsentiert sie einen neuen statistischen Ansatz für die Expressionsanalyse zwischen zwei verschiedenen Spezies und ist auch auf andere Artenvergleiche anwendbar, was das Bestimmen von artenspezifischem Verhalten von Genen in wichtigen Signalwegen und Genfamilien ermöglicht. Um eine unterschiedliche Regulation von wichtigen molekularen Mechanismen zu identifizieren, wurde die Detektion von sich zwischen den beiden Spezies unterscheidender Genexpression auf das Niveau von Signalwegen, Genfamilien und ausgewählter Einzelgene angelegt. Die Untersuchung zeigt zum ersten Mal, dass sich die Genexpression im pluripotenten Zellpool von Embryonen des Präimplantationsstadiums zwischen Maus und Ratte teilweise substantiell unterscheidet. Dies könnte mit ein Grund sein, weshalb es bis anhin so schwierig war, ES-Zellen der Ratte unter Mausbedingungen zu generieren und zu kultivieren. Einige der Gene, bei welchen zwischen den Arten eine unterschiedliche Expression hat festgestellt werden können, sind schon länger als wichtige Faktoren in der Pluripotenzerhaltung von ES-Zellen bekannt, dazu gehören unter anderem Sox2 oder Stat3, oder sie spielen eine Rolle in der Reprogrammierung von somatischen zu pluripotenten Zellen, wie c-Myc, Klf4 und p53. Diese Gene könnten deshalb interessante Kandidaten für weitere in vitro Analysen von ES-Zellen der Ratte sein. Diese unterschiedliche Regulierung von kritischen Genen könnte ein Auslöser für die Untersuchung von deren Funktion in vitro an ES-Zellen von Maus und Ratte sein. Des Weiteren könnte dieses Wissen zu Verbesserungen in der Etablierung von ES-Zellen von Maus und Ratte führen. Dafür bedarf es auch in Zukunft eines umfangreicheren Verständnisses der molekularen Mechanismen, welche für die Kontrolle und Erhaltung von Pluripotenz verantwortlich sind. Dies, um authentische und pluripotente ES-Zellen der Ratte zu derivieren und somit auch die Herstellung von transgenen Tieren via Gentargeting zu erleichtern, denn solche Modelle sind in der biomedizinischen Forschung unentbehrlich.

Abstract

Summary  



SUMMARY

The transition between morula and blastocyst stage during preimplantation development represents the first differentiation event of embryogenesis. Morula cells undergo the first cellular specialization and produce two well-defined populations of cells, the trophoblast and the inner cell mass (ICM). Embryonic stem cells (ESCs) with unlimited self-renewal capacity are believed to represent the in vitro counterpart of the ICM cells. A unique and complex signaling network allows embryonic stem cells (ESCs) to undergo extended proliferation in vitro, while maintaining their capacity for multilineage differentiation. Genuine ESC identity can only be maintained when both self-renewal and suppression of differentiation are active and balanced. Despite many efforts have been made in the past years, aimed at understanding the molecular factors driving and controlling pluripotency in vivo and in vitro, the precise mechanisms of how these processes are regulated remain largely unknown. Therefore, the overall goal of this thesis was to gain knowledge on the molecular mechanisms that control stemness in pluripotent stem cells. The work was divided into two different studies: the first was focused on the function of pluripotency related genes in ESCs and the second consisted in a genome wide expression analysis of mouse and rat preimplantation stage embryos.

The activation of the LIF/STAT3 signaling was shown to be sufficient to maintain ESCs in an undifferentiated and pluripotent state. Thus, in a first study the importance of STAT3 in the establishment of ESCs was investigated. In order to identify new STAT3 target genes, ESCs overexpressing STAT3 were derived from a non-permissive mouse strain and their expression profiles were compared with wild type ESCs. Several genes were detected as potential key-players involved in maintenance of pluripotency in ESCs. The function of two of these genes, Pramel6 and Pramel7, was extensively characterized. We identify Pramel7 (preferentially expressed antigen in melanoma-like 7) as a novel factor crucial for maintenance of pluripotency and LIF-mediated self-renewal in ESCs. In vivo, Pramel7 expression was exclusively found in the pluripotent pools of cells, namely, the central part of the morula and the inner cell mass of the blastocyst. Ablation of Pramel7 induced ESC differentiation, whereas its overexpression was sufficient to support long-term self-renewal in the absence of exogenous LIF. Furthermore, Pramel7 overexpression suppressed differentiation in ESCs in vitro and in vivo. This process was reversible, as on transgene excision cells reverted to a LIF- dependent state and regained their capacity to participate in the formation of chimeric mice. Molecularly, LIF directly controls Pramel7 expression, involving both STAT3-dependent transcriptional regulation and PI3K-dependent phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). Pramel7 expression in turn confers constitutive self-renewal and prevents differentiation through inactivation of extracellular signal-regulated kinase phosphorylation. Accordingly, knockdown of Pramel7 promotes ESC differentiation in presence of LIF and even on forced STAT3- activation. Thus, with this study we demonstrated that Pramel7 represents a central and essential factor in the signaling network regulating pluripotency and self-renewal in ESCs.

Rats represent an optimal animal model for the investigation of human diseases and in some research fields is often, due to its bigger size and higher genetic diversity, preferred to the mouse. Despite the benefits of working with rats, the impossibility of generating germ line competent rat ESCs has given the mouse a clear advantage over the rat in the generation of new transgenic models. All the efforts made for establishing authentic rat ESCs have failed in the last 30 years and only recently, by using defined culture conditions, genuine pluripotent rat ESCs have been established for the first time, from different strains. Although, both mouse and rat ESCs can be derived from the ICM cells, they differ in their in vitro stability. We aimed in our study at the identification of differences at the transcriptional level between the mouse and the rat during the developmental period in which the ICM cells are formed, since they represent the source of ESCs derivation. We performed a microarray analysis in which we compared Summary

the transcriptome of mouse and rat morula, blastocyst, and ICM. This is the first study investigating the gene expression changes during the transition from morula to blastocyst in the rat preimplantation development. Moreover, it represents a new example of statistical approach for cross species analysis, applicable also to other species comparisons, that allows to highlight the species-specific behaviour of genes within important pathways and families. In order to identify alternative regulation of important molecular mechanisms the investigation of differential gene expression between the two species was extended at the level of signaling pathways, gene families, and single selected genes of interest. This study reports for the first time that in the pluripotent pool of cells of the rat and mouse preimplantation embryo substantial differential regulation of genes is present, which might explain the difficulties observed for the derivation and culture of rat ESCs using murine conditions. Some of the genes differentially expressed are already known to be important factors in the maintenance of pluripotency in ESCs, like for example Sox2 or Stat3, or play a role in reprogramming somatic cells to pluripotency like c-Myc, Klf4 and p53 and would therefore represent interesting candidates to further analyze in vitro in the rat ESCs. The differential regulation of critical genes could represent the starting point for analyzing their function in vitro in mouse and rat ESCs. Furthermore, this knowledge could be critical for the improvement of the derivation and maintenance of rat ESCs. A broader knowledge on the molecular mechanisms that occur in rat ESCs would improve the efficiency of establishing stable authentic pluripotent rat ESCs and therefore it would facilitate the generation via gene targeting of transgenic rat models, which are indispensable for the biomedical research. Zusammenfassung  



ZUSAMMENFASSUNG

Das erste Differenzierungsereignis während der Embryonalentwicklung in der Präimplantationsphase ist der Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium. Dabei durchleben die Morulazellen die allererste zelluläre Spezifizierung, welche in zwei voneinander unterscheidbaren Zellpopulationen resultiert, dem Trophoblasten und der inneren Zellmasse (ICM). Es wird angenommen, dass embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mit ihrer Fähigkeit, sich unendlich erneuern zu können, das in vivo-Pendant zu den Zellen der inneren Zellmasse darstellen. Die Kultivierung und Proliferation von embryonalen Stammzellen in vitro wird durch einen einzigartigen und komplexen Signalverbund ermöglicht. Dieser hält die Zellen in einem pluripotenten Zustand, ohne dass diese die Eigenschaft verlieren, Gewebe aller drei Keimblätter bilden zu können. Dieser Zustand kann nur erreicht werden, wenn einerseits der Selbsterneuerungsmechanismus funktioniert und andererseits die Differenzierung in genügendem Masse unterdrückt wird, was bedeutet, dass eine bestimmte Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung gewährleistet sein muss. In den letzen Jahrzehnten wurde ein enormer Aufwand betrieben, um dem molekularen Geheimnis der Pluripotenzerhaltung in vitro und in vivo auf den Grund zu kommen. Trotzdem ist immer noch sehr unklar, wie die Mechanismen genau funktionieren. Das Gesamtziel dieser Studie war es deshalb, weiteres Wissen über die molekularen Prozesse, welche die Pluripotenzerhaltung kontrollieren, zu erlangen. Die Arbeit wurde anfänglich in zwei verschiedene Studien aufgeteilt: Die erste befasste sich mit der Funktion von Genen, welche mit Pluripotenz in Verbindung gebracht werden können, die zweite bestand in einer vergleichenden Genexpressionsanalyse von Maus- und Rattenembryonen während verschiedenen Präimplantationsstadien.

Es ist bekannt, dass die Aktivierung des LIF/STAT3 Signalwegs ausreicht, um ES-Zellen in einem undifferenzierten und pluripotenten Zustand zu erhalten. Deshalb untersuchten wir in einem ersten Ansatz die Wichtigkeit von STAT3 in der Etablierung von ES-Zellen. Um neue STAT3-Zielgene zu identifizieren, wurden STAT3-überexprimierende ES-Zellen aus einem nicht-permissiven Hintergrund etabliert, um später deren Expressionsprofil mit demjenigen von Wildtyp ES-Zellen zu vergleichen. Mehrere Gene zeigten eine veränderte Expression. Einige von ihnen wurden als potentielle Schlüsselfaktoren der Pluripotenzerhaltung in Betracht gezogen. Von Pramel6 und Pramel7, zwei dieser Kandidatengene, wurde die Funktion umfassend analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass Pramel7 (preferentially expressed antigen in melanoma-like 7) eine wichtige Rolle in der Erhaltung der Pluripotenz und in der vom LIF/STAT3 Signalweg vermittelten Selbsterneuerung von ES-Zellen einnimmt. Es zeigte sich weiter, dass Pramel7 in vivo exklusiv in vollumfänglich pluripotenten Zellen exprimiert wird, also im zentralen Zellkompartement des Morulastadiums und in der inneren Zellmasse der Blastozyste. In vitro wurde beobachtet, dass das Fehlen von Pramel7-Expression zur Differenzierung von ES-Zellen führt, dessen Überexpression hingegen zur Folge hatte, dass die Selbsterneuerung der Zellen ohne Zugabe von exogenem LIF über längere Zeit aufrecht erhalten werden konnte. Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von Pramel7 die Differenzierung von ES-Zellen in vitro und in vivo. Dieser Prozess ist umkehrbar: Nach der Entfernung des Pramel7- Transgens, welches die Überexpression verursachte, wurden die Zellen erneut LIF-abhängig und erlangten die Fähigkeit, Chimären zu bilden. Auf molekularer Ebene wird Pramel7 direkt durch LIF kontrolliert, einerseits via STAT3-abhängige Transkriptionsregulation, andererseits durch PI3K- abhängige Phosphorylierung der Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β). Pramel7-Expression wiederum gewährleistet konstitutive Selbsterneuerung und verhindert Differenzierung durch Inhibition der Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinase (ERK). Dementsprechend begünstigt der Knockdown von Pramel7 die Differenzierung von ES-Zellen, auch unter Zugabe von exogenem LIF und sogar nach erzwungener STAT3-Expression. Zusammenfassend wurde in dieser Studie gezeigt, dass Pramel7 eine zentrale und wichtige Rolle im pluripotenzerhaltenden Signalverbund der Selbsterneuerung von ES-Zellen darstellt.

Die Ratte ist ein optimales Modell für die Untersuchung von menschlichen Krankheiten. In einigen wissenschaftlichen Bereichen wird sie der Maus vorgezogen, hauptsächlich wegen dem grösseren Körper und der höheren genetischen Diversität. Trotz dieser Vorteile war es für lange Zeit nicht möglich, keimbahnkompetente ES-Zellen von Ratten zu generieren, was der Maus im Bereich der Herstellung von transgenen Modellen einen klaren Vorteil verschaffte. In den letzten 30 Jahren schlugen trotz grösster Anstrengungen alle Versuche fehl, authentische Ratten ES-Zellen zu generieren. Erst kürzlich gelang es einer Forschungsgruppe funktionelle ES-Zellen von verschiedenen Rattenstämmen unter definierten Kulturbedingungen zu derivieren. Obwohl nun ES-Zellen aus der inneren Zellmasse von Maus und Ratte hergestellt werden können, unterscheiden sich die Zelllinien der verschiedenen Spezies in ihrer Stabilität in vitro.

Die zweite Studie setzte sich zum Ziel, Unterschiede zwischen Maus und Ratte während der Transition vom Morula- zum Blastozystenstadium auf transkriptioneller Ebene aufzudecken, da die Zellen der inneren Zellmasse der Blastozysten das Ursprungsmaterial für die Generierung von ES- Zellen darstellen. Dafür wurde eine Microarrayanalyse durchgeführt, in welcher die Transkriptome von Morulae, Blastozysten und innerer Zellmassen der Maus und der Ratte verglichen wurden. Dies ist die erste Studie, welche die Veränderungen der Genexpression während dem Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium untersucht. Darüber hinaus repräsentiert sie einen neuen statistischen Ansatz für die Expressionsanalyse zwischen zwei verschiedenen Spezies und ist auch auf andere Artenvergleiche anwendbar, was das Bestimmen von artenspezifischem Verhalten von Genen in wichtigen Signalwegen und Genfamilien ermöglicht. Um eine unterschiedliche Regulation von wichtigen molekularen Mechanismen zu identifizieren, wurde die Detektion von sich zwischen den beiden Spezies unterscheidender Genexpression auf das Niveau von Signalwegen, Genfamilien und ausgewählter Einzelgene angelegt. Die Untersuchung zeigt zum ersten Mal, dass sich die Genexpression im pluripotenten Zellpool von Embryonen des Präimplantationsstadiums zwischen Maus und Ratte teilweise substantiell unterscheidet. Dies könnte mit ein Grund sein, weshalb es bis anhin so schwierig war, ES-Zellen der Ratte unter Mausbedingungen zu generieren und zu kultivieren. Einige der Gene, bei welchen zwischen den Arten eine unterschiedliche Expression hat festgestellt werden können, sind schon länger als wichtige Faktoren in der Pluripotenzerhaltung von ES-Zellen bekannt, dazu gehören unter anderem Sox2 oder Stat3, oder sie spielen eine Rolle in der Reprogrammierung von somatischen zu pluripotenten Zellen, wie c-Myc, Klf4 und p53. Diese Gene könnten deshalb interessante Kandidaten für weitere in vitro Analysen von ES-Zellen der Ratte sein. Diese unterschiedliche Regulierung von kritischen Genen könnte ein Auslöser für die Untersuchung von deren Funktion in vitro an ES-Zellen von Maus und Ratte sein. Des Weiteren könnte dieses Wissen zu Verbesserungen in der Etablierung von ES-Zellen von Maus und Ratte führen. Dafür bedarf es auch in Zukunft eines umfangreicheren Verständnisses der molekularen Mechanismen, welche für die Kontrolle und Erhaltung von Pluripotenz verantwortlich sind. Dies, um authentische und pluripotente ES-Zellen der Ratte zu derivieren und somit auch die Herstellung von transgenen Tieren via Gentargeting zu erleichtern, denn solche Modelle sind in der biomedizinischen Forschung unentbehrlich.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Bürki Kurt, Hennet Thierry,
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:10 Mar 2012 10:35
Last Modified:07 Apr 2020 06:30
Number of Pages:126
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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