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Influence of dietary fat content on vascular reactivity and expression profiles: novel role of vascular Cyp2E1


Damjanović, Marlen. Influence of dietary fat content on vascular reactivity and expression profiles: novel role of vascular Cyp2E1. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Prävalenz für Fettleibigkeit ist weltweit gestiegen. Neueste Studien zeigen, dass sogar nach einer Gewichtsreduktion ein erhöhtes Risiko zur Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen besteht. Die Hauptursache für die Entstehung von Fettleibigkeit ist eine fettreiche Ernährung, welche zu einer Gewichtszunahme, Glukoseintoleranz und vaskulären Dysfunktion führen kann. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Gene zu identifizieren, deren Expression sich aufgrund einer Diät hohen Fettgehalts ändert und diese Änderung bestehen bleibt nachdem der Fettgehalt der Diät reduziert wurde. In dieser Arbeit wurde ein etabliertes Mausmodell für Diätinduzierte Fettleibigkeit verwendet: Vier Wochen alte, männliche Mäuse des Stammes C57BL/6J wurden entweder für 30 Wochen mit einer Kontrolldiät gefüttert oder mit einer Diät hohen Fettgehalts oder die Mäuse wurden zunächst für 15 Wochen mit der Diät hohen Fettgehalts und abschliessend für 15 Wochen mit der Kontrolldiät gefüttert. Die Verfütterung der Diät hohen Fettgehalts führte nach 30 Wochen zu einer Gewichtszunahme und zu einer verminderten Glukosetoleranz. Es wurden unterschiedliche Auswirkungen auf die durch Phenylephrin-, 5-Hydroxytryptamin und Acetlycholin-induzierte Vasokontraktion in der Thorakalaorta der Mäuse, die mit der Diät hohen Fettgehalts gefüttert wurden als auch in den Mäusen, die beide Diäten erhielten, festgestellt. Eine DNA Exon Microarray Analyse, die mit Aortengewebe (n=3 Replikate pro Gruppe) der drei Mausgruppen durchgeführt wurde, identifizierte nur wenige Gene mit relativ geringen Expressionsunterschieden (< 2.5 fach). Auf Genebene wurden 37 Gene und 46 auf Exonebene gefunden. Die meisten der identifizierten Gene sind an der Regulation der vaskulären Funktion beteiligt. Die Validierung der Gene und Proteine carbonic anhydrase 3 (Car3, Car3) und cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 (Cyp2E1, Cyp2E1) mittels quantitativer RT-PCR und Western Blot zeigte, dass die Gen- und Proteinexpression durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten, herunterreguliert ist. Die Genexpression des Gens cell-death-inducing DFFA-like effector c (Cidec) ist durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten herunterrguliert wohingegen die Proteinexpression hochreguliert ist. Für das Gen Dipeptidylpeptidase 10 (Dpp10) konnte nur gezeigt werden, dass die Genexpression durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten, hochreguliert ist. Da Cyp2E1 die grössten und signifikantesten Expressionsunterschiede (2.2 fach, p<0.002) zeigte, wurde es ausführlicher charakterisiert. Auf der Ebene der mRNA Transkripte wurden neben dem vollständigen Transkript zwei neue Cyp2E1 Spleissformen in der Aorta der Kontrolltiere identifiziert. Die erste Spleissform enthält möglicherweise bis auf einen verkürzten 3`untranslatierten Bereich im Exon 9 die vollständige Cyp2E1 Nukleotidsequenz. Der zweiten Spleissform fehlen Exon 4-6. Auf der Proteinebene konnte das vollständige Cyp2E1 Protein nicht detektiert werden, aber stattdessen wurden zwei neue Proteinisoformen von Cyp2E1 mit einer Molekulargrösse von 39 und 45 kDa identifiziert. Zudem zeigte die Untersuchung der Gefässreaktivität der Thorakalaorta von Wildtyp und Cyp2E1-defizienten Mäusen, dass Cyp2E1 sowohl eine Rolle in der Regulation der 5-Hydroxytryptamin-induzierten Vasokontraktion als auch in der Vasorelaxation und Vasokontraktion durch Acetylcholin, spielt. Es scheint, dass reaktive Sauerstoffverbindungen und Stickstoffmonoxid zur Regulation beitragen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Verfütterung einer Diät hohen Fettgehalts zu einer Gewichtszunahme, einer Glukoseintoleranz und zu einer Veränderung der Gefässreaktivität führen kann. Zum Teil konnten Veränderungen der Gefässfunktion, die durch die Verabreichung einer Diät hohen Fettgehalts verursacht wurden, nicht durch eine Reduktion des Fettgehalts rückgängig gemacht werden. Zusätzlich legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass Cyp2E1 Spleissformen, die aufgrund der verschiedenen Diäten unterschiedlich exprimiert sind, an der Regulation der vaskulären Funktion beteiligt sein könnten. Zusammenfassend deuten die Resultate darauf hin, dass Cyp2E1 eine zentrale Rolle in der Entstehung von Gefässkrankheiten beim Menschen übernehmen könnte.

Summary
The prevalence of obesity has risen worldwide. Main reason responsible for the development of obesity is intake of nutrition-rich in fat. Recent studies suggest that obesity is associated with an increased risk of cardiovascular diseases even after reduction of body weight. Elevated body weight is frequently associated with glucose intolerance and vascular dysfunction. The aim of the present study was to investigate whether alterations in vascular reactivity are associated with changes in steady-state mRNA expression levels and gene splicing due to high-dietary fat content and whether these changes sustain after high-dietary fat content is reduced. A well-established mouse model of diet-induced obesity was used. 4 weeks old, male C57BL/6J mice were either fed with a control diet (CD) or a high-fat diet (HFD) for 30 weeks or with a HFD for 15 week followed by a CD for 15 weeks (HFD/CD). Only feeding with HFD increased body weight and led to an impaired glucose tolerance in mice. HFD and HFD/CD showed hetergenous effects on contractile responses induced by phenylephrine, 5-hydroxytryptamine and acetylcholine in thoracic aorta of mice. Subsequent DNA exon microarray analysis using aortic tissue (n=3 replicates/group) from these mice revealed very few genes with relatively small expression changes (<2.5 fold change). At a whole gene level 37 genes and 46 at an exon-specific level were identified. Gene Ontology classification showed that most of the genes are assigned to biological processes involved in regulation of vascular function. mRNA and protein expression levels of the genes carbonic anhydrase 3 (Car3, Car3) and cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 (Cyp2E1, Cyp2E1) were confirmed to be downregulated by HFD and HFD/CD using quantitative RT-PCR and Western Blot, respectively. mRNA expression level of cell-death- inducing DFFA-like effector c (Cidec) was downregulated whereas protein expression level was upregulated by HFD and HFD/CD. Dipeptidylpeptidase 10 (Dpp10) was confirmed to be upregulated by HFD and HFD/CD only by quantitative RT-PCR. Cyp2E1 showed highest (fold change of 2.2) and most significant changes (p<0.002) in gene expression and therefore was characterized in more detail. On mRNA transcript level, two novel aortic Cyp2E1 mRNA transcripts were identified in the CD group in addition to full-length Cyp2E1. The first transcript possibly consists of the full-length nucleotide sequence with truncated 3`untranslated region in exon 9, while the second transcript lacks exons 4, 5 and 6. On protein level no full-length Cyp2E1 was detectable but two novel aortic Cyp2E1 isoforms at 39 and 45 kDa were identified in all dietary treatment groups. Furthermore, vascular function experiments using thoracic aorta of wild type and Cyp2E1-deficient mice suggest that Cyp2E1 regulates 5-hydroxytryptamine-induced contractions but also acetylcholine-induced relaxation and contraction. Possible mechanisms involve contribution of reactive oxygen species and nitric oxide. In conclusion, the present data show that dietary fat affects body weight, glucose tolerance and vascular reactivity. Some changes in vascular reactivity remained after dietary fat was reduced. Differential expression levels of aortic Cyp2E1 splice variants during dietary interventions and its role in the regulation of vascular function suggest that this molecule is a novel player in obesity-associated vascular diseases even after fat intake is reduced.

Abstract

Die Prävalenz für Fettleibigkeit ist weltweit gestiegen. Neueste Studien zeigen, dass sogar nach einer Gewichtsreduktion ein erhöhtes Risiko zur Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen besteht. Die Hauptursache für die Entstehung von Fettleibigkeit ist eine fettreiche Ernährung, welche zu einer Gewichtszunahme, Glukoseintoleranz und vaskulären Dysfunktion führen kann. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Gene zu identifizieren, deren Expression sich aufgrund einer Diät hohen Fettgehalts ändert und diese Änderung bestehen bleibt nachdem der Fettgehalt der Diät reduziert wurde. In dieser Arbeit wurde ein etabliertes Mausmodell für Diätinduzierte Fettleibigkeit verwendet: Vier Wochen alte, männliche Mäuse des Stammes C57BL/6J wurden entweder für 30 Wochen mit einer Kontrolldiät gefüttert oder mit einer Diät hohen Fettgehalts oder die Mäuse wurden zunächst für 15 Wochen mit der Diät hohen Fettgehalts und abschliessend für 15 Wochen mit der Kontrolldiät gefüttert. Die Verfütterung der Diät hohen Fettgehalts führte nach 30 Wochen zu einer Gewichtszunahme und zu einer verminderten Glukosetoleranz. Es wurden unterschiedliche Auswirkungen auf die durch Phenylephrin-, 5-Hydroxytryptamin und Acetlycholin-induzierte Vasokontraktion in der Thorakalaorta der Mäuse, die mit der Diät hohen Fettgehalts gefüttert wurden als auch in den Mäusen, die beide Diäten erhielten, festgestellt. Eine DNA Exon Microarray Analyse, die mit Aortengewebe (n=3 Replikate pro Gruppe) der drei Mausgruppen durchgeführt wurde, identifizierte nur wenige Gene mit relativ geringen Expressionsunterschieden (< 2.5 fach). Auf Genebene wurden 37 Gene und 46 auf Exonebene gefunden. Die meisten der identifizierten Gene sind an der Regulation der vaskulären Funktion beteiligt. Die Validierung der Gene und Proteine carbonic anhydrase 3 (Car3, Car3) und cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 (Cyp2E1, Cyp2E1) mittels quantitativer RT-PCR und Western Blot zeigte, dass die Gen- und Proteinexpression durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten, herunterreguliert ist. Die Genexpression des Gens cell-death-inducing DFFA-like effector c (Cidec) ist durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten herunterrguliert wohingegen die Proteinexpression hochreguliert ist. Für das Gen Dipeptidylpeptidase 10 (Dpp10) konnte nur gezeigt werden, dass die Genexpression durch die Diät hohen Fettgehalts als auch die Verfütterung beider Diäten, hochreguliert ist. Da Cyp2E1 die grössten und signifikantesten Expressionsunterschiede (2.2 fach, p<0.002) zeigte, wurde es ausführlicher charakterisiert. Auf der Ebene der mRNA Transkripte wurden neben dem vollständigen Transkript zwei neue Cyp2E1 Spleissformen in der Aorta der Kontrolltiere identifiziert. Die erste Spleissform enthält möglicherweise bis auf einen verkürzten 3`untranslatierten Bereich im Exon 9 die vollständige Cyp2E1 Nukleotidsequenz. Der zweiten Spleissform fehlen Exon 4-6. Auf der Proteinebene konnte das vollständige Cyp2E1 Protein nicht detektiert werden, aber stattdessen wurden zwei neue Proteinisoformen von Cyp2E1 mit einer Molekulargrösse von 39 und 45 kDa identifiziert. Zudem zeigte die Untersuchung der Gefässreaktivität der Thorakalaorta von Wildtyp und Cyp2E1-defizienten Mäusen, dass Cyp2E1 sowohl eine Rolle in der Regulation der 5-Hydroxytryptamin-induzierten Vasokontraktion als auch in der Vasorelaxation und Vasokontraktion durch Acetylcholin, spielt. Es scheint, dass reaktive Sauerstoffverbindungen und Stickstoffmonoxid zur Regulation beitragen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Verfütterung einer Diät hohen Fettgehalts zu einer Gewichtszunahme, einer Glukoseintoleranz und zu einer Veränderung der Gefässreaktivität führen kann. Zum Teil konnten Veränderungen der Gefässfunktion, die durch die Verabreichung einer Diät hohen Fettgehalts verursacht wurden, nicht durch eine Reduktion des Fettgehalts rückgängig gemacht werden. Zusätzlich legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass Cyp2E1 Spleissformen, die aufgrund der verschiedenen Diäten unterschiedlich exprimiert sind, an der Regulation der vaskulären Funktion beteiligt sein könnten. Zusammenfassend deuten die Resultate darauf hin, dass Cyp2E1 eine zentrale Rolle in der Entstehung von Gefässkrankheiten beim Menschen übernehmen könnte.

Summary
The prevalence of obesity has risen worldwide. Main reason responsible for the development of obesity is intake of nutrition-rich in fat. Recent studies suggest that obesity is associated with an increased risk of cardiovascular diseases even after reduction of body weight. Elevated body weight is frequently associated with glucose intolerance and vascular dysfunction. The aim of the present study was to investigate whether alterations in vascular reactivity are associated with changes in steady-state mRNA expression levels and gene splicing due to high-dietary fat content and whether these changes sustain after high-dietary fat content is reduced. A well-established mouse model of diet-induced obesity was used. 4 weeks old, male C57BL/6J mice were either fed with a control diet (CD) or a high-fat diet (HFD) for 30 weeks or with a HFD for 15 week followed by a CD for 15 weeks (HFD/CD). Only feeding with HFD increased body weight and led to an impaired glucose tolerance in mice. HFD and HFD/CD showed hetergenous effects on contractile responses induced by phenylephrine, 5-hydroxytryptamine and acetylcholine in thoracic aorta of mice. Subsequent DNA exon microarray analysis using aortic tissue (n=3 replicates/group) from these mice revealed very few genes with relatively small expression changes (<2.5 fold change). At a whole gene level 37 genes and 46 at an exon-specific level were identified. Gene Ontology classification showed that most of the genes are assigned to biological processes involved in regulation of vascular function. mRNA and protein expression levels of the genes carbonic anhydrase 3 (Car3, Car3) and cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 (Cyp2E1, Cyp2E1) were confirmed to be downregulated by HFD and HFD/CD using quantitative RT-PCR and Western Blot, respectively. mRNA expression level of cell-death- inducing DFFA-like effector c (Cidec) was downregulated whereas protein expression level was upregulated by HFD and HFD/CD. Dipeptidylpeptidase 10 (Dpp10) was confirmed to be upregulated by HFD and HFD/CD only by quantitative RT-PCR. Cyp2E1 showed highest (fold change of 2.2) and most significant changes (p<0.002) in gene expression and therefore was characterized in more detail. On mRNA transcript level, two novel aortic Cyp2E1 mRNA transcripts were identified in the CD group in addition to full-length Cyp2E1. The first transcript possibly consists of the full-length nucleotide sequence with truncated 3`untranslated region in exon 9, while the second transcript lacks exons 4, 5 and 6. On protein level no full-length Cyp2E1 was detectable but two novel aortic Cyp2E1 isoforms at 39 and 45 kDa were identified in all dietary treatment groups. Furthermore, vascular function experiments using thoracic aorta of wild type and Cyp2E1-deficient mice suggest that Cyp2E1 regulates 5-hydroxytryptamine-induced contractions but also acetylcholine-induced relaxation and contraction. Possible mechanisms involve contribution of reactive oxygen species and nitric oxide. In conclusion, the present data show that dietary fat affects body weight, glucose tolerance and vascular reactivity. Some changes in vascular reactivity remained after dietary fat was reduced. Differential expression levels of aortic Cyp2E1 splice variants during dietary interventions and its role in the regulation of vascular function suggest that this molecule is a novel player in obesity-associated vascular diseases even after fat intake is reduced.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hajnal Alex, Barton Matthias, Wolfrum Christian
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > University Hospital Zurich > Clinic for Angiology
07 Faculty of Science > Institute of Molecular Life Sciences
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:610 Medicine & health
Language:Latin
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:03 Dec 2012 13:56
Last Modified:15 Apr 2021 14:20
Number of Pages:128
OA Status:Green

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