MicroRNAs and vascular remodeling in pulmonary hypertension

Abstract

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a devastating condition defined by the sustained elevation of pulmonary vascular resistance that rapidly leads to right heart failure and death when left untreated. The pathogenesis of PAH is characterized by vascular remodeling and, among others, the dysregulated expression of the bone morphogenetic protein receptor type II (BMPR2). Mutations in the gene encoding BMPR2 were identified in more than 70% of hereditary PAH cases and, moreover, reduced expression levels of BMPR2 were also found in patients with non-genetic PAH and in other forms of pulmonary hypertension (PH) as well as in animal models mimicking the disease. The different WHO classes of PH are provided as Table 1 within the introduction. It is largely accepted that the loss of BMPR2 represents a key event in the pathogenesis of PAH, and, moreover, might constitute a final common pathway in other forms of PH by enhancing proliferation and apoptosis resistance of cells surrounding the small pulmonary arteries eventually resulting in vascular remodeling. So far, the mechanisms leading to reduced expression of BMPR2 remained unclear.
The focus of this PhD thesis was set on the identification of mechanisms that control the expression of BMPR2 in PAH. Since microRNAs (miRNAs) have emerged as novel repressors of gene expression, it was hypothesized that miRNAs might play a role in the modulation of BMPR2. Using a database for computational prediction of miRNA-target interactions several miRNAs encoded by the microRNA cluster 17/92 (miR-17/92) were retrieved as potential regulators of BMPR2. The first part of my thesis provides evidence that the expression of BMPR2 is directly regulated by two miRNAs (miR-17 and miR-20a) derived from miR-17/92. Moreover, stimulation experiments in endothelial cells revealed increased expression of miR-17/92 by interleukin (IL-) 6, a cytokine involved in the pathogenesis of PAH. The context of IL-6, miR-17/92 and BMPR2 was further demonstrated by showing that persistent activation of the IL-6 pathway led to repressed protein expression of BMPR2. Consistent with the hypothesis of a miR-17/92-mediated reduction of BMPR2, a recent study showed increased expression of miR-17 and miR-20a in the lungs of PH animals. Therefore, to address the pathophysiological relevance of miR-20a in vivo, we investigated whether specific inhibition of miR-20a by small antisense RNA oligonucleotides (antagomiRs) could restore functional levels of BMPR2 and, in turn, might prevent pulmonary arterial vascular remodeling. Presented in the second part of this thesis, we found that antagonizing miR-20a in the hypoxia-induced mouse model for pulmonary hypertension upregulated the expression levels of BMPR2 and, moreover, significantly reduced wall thickness and luminal occlusion of small pulmonary arteries. Consistently, the proliferation of human pulmonary arterial smooth muscle cells in vitro was found to be reduced upon transfection with antagomiR-20a. These data emphasize that treatment with antagomiR-20a restores the expression of BMPR2 in pulmonary arteries and prevents the development of vascular remodeling. Therefore, the application of antagomiR-20a could be a promising approach for a causative therapy of PH. Apart from BMP signaling, it was shown that the IL-6 signaling cascade significantly contributes to the maintenance of the vasculature. Along this line, lung-specific IL-6-over expressing transgenic mice spontaneously developed PH accompanied by vasculopathic changes. Moreover, the serum concentration of IL-6 was also found to be increased in patients with PAH. Regarding the importance of IL-6 and miR-17/92 for PH, we further investigated the interplay of miR-17/92 and IL-6 signaling and its impact on an inflammatory model, the acute-phase response. In the last part of this thesis, we provide evidence that IL-6 upregulated the expression of miR-17/92 in different cell types and that one miRNA derived from miR- 17/92, miR-18a, was a potent activator of IL-6 signaling by targeting an endogenous repressor of this pathway. These data reveal for the first time a miRNA mediated positive feedback loop of IL-6 signal transduction and thus contribute to the understanding of the complex regulatory mechanisms within the signal transduction of IL-6.

Zusammenfassung
Die pulmonale Hypertonie (PH) ist der Überbegriff für verschiedene Krankheitsbilder, welche in einer signifikanten Erhöhung des Blutdrucks im Lungenkreislauf resultieren und auf Grund des vermehrten rechtsventrikulären Afterloads letztendlich zum Rechtsherzversagen führt. Die chronisch Drucksteigerung in der Lungenblutbahn wird im Wesentlichen durch drei pathogenetische Ereignisse verursacht: eine Mikrothrombosierung der Gefässbahn, eine übermässige Vasokonstriktion, sowie durch einen fibrotischen Gefässumbau („Remodeling“). Bei letzterem scheint das Gen BMPR2 (bone morphogenetic protein – Rezeptor Typ II) eine entscheidende Rolle zu spielen. In ca. 70% aller Patienten mit einer familären Form der pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH) ist das BMPR2-Gen durch DNA-Mutationen inaktiviert. Interessanterweise wurde aber auch in nicht-vererbaren Formen der PAH sowie in anderen Formen der PH eine verminderte Expression von BMPR2 beschrieben. Auch wenn die Rolle von BMPR2 nicht definitiv geklärt ist, so könnte die reduzierte Expression von BMPR2 den Gefässumbau im Wesentlichen mitverursachen, da durch den Verlust von BMPR2 sowohl die Proliferation als auch die Apoptose-Resistenz von Endothelzellen und glatten Gefässmuskelzellen erhöht wird. Die molekularbiologischen Mechanismen, die zu einer verringerten Oberflächenexpression von BMPR2 in den nicht vererbaren Formen der PH führen, sind jedoch bisher unbekannt.
Der Schwerpunkt meiner Doktorabeit war die Erforschung der Regulation der BMPR2- Expression im Kontext der PH. Auf Grund von Studien, die eine Inhibierung des Translations-Prozesses von BMPR2 während der Entwicklung von PH implizierten, untersuchte ich die post-transkriptionale Regulation von BMPR2 durch so genannte microRNAs (miRNAs). miRNAs sind kleine, nicht proteinkodierende RNA Moleküle, denen ein grosses Potential im Feld der post-transkriptionalen Genregulation zugesprochen wird. Mit Hilfe von Computerprogrammen, die Sequenzähnlichkeiten zwischen miRNAs und potentiell miRNA-regulierten Genen analysieren, konnte ich den miRNA cluster miR-17/92 als möglichen Regulator von BMPR2 identifizieren. Weiterführende Experimente bestätigten, dass zwei miRNAs (miR-17 und miR-20a) aus dem miR-17/92 cluster direkt und spezifisch die Expression von BMPR2 kontrollieren. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation von pulmonalen Endothelzellen mit Interleukin (IL)-6, dessen Serumspiegel bei PAH-Patienten erhöht ist, die Expression von miR-17/92 erhöht war und dass eine Überaktivierung der IL-6 Signalkaskade zu einer Verminderung der BMPR2-Expression führte. Um die physiologische Bedeutung von miR-20a für den Krankheitsverlauf der PH zu untersuchen, verwendete ich das Mausmodell der Hypoxie-induzierten PH, in dem die Expression vom miR-20a gezielt durch die Applikation von komplementären, anti-sense- orientierten RNA Molekülen („AntagomiRs“) ausgeschaltet wurde. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Exposition der Tiere gegenüber chronisch-hypoxischen Konditionen zu einer Verringerung der BMPR2-Expression in der Lunge führte. Die Antagonisierung von miR-20a konnte dabei die BMPR2-Expression auf das Niveau der normoxischen Kontrollgruppe normalisieren. Desweiteren zeigten physiologische Untersuchungen, dass sowohl die für PH charkteristische rechtsventrikuläre Hypertrophie als auch der Gefässumbau von pulmonalen Arteriolen durch Inhibierung von miR-20a signifikant reduziert wurde. Diese Daten untermauern die Hypothese, dass miR-20a ein wichtiger Modulator für die Expression von BMPR2 und somit ein entscheidender Faktor im Prozess des Gefässumbaus ist. Daher könnten Medikamente, die auf eine Inhibierung von miR-20a abzielen, einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von PH darstellen. Im letzten Teil meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Wechselspiel von IL-6 und dem miR- 17/92 cluster. Am Modell der hepatischen Akut-Phase-Reaktion, die eine sehr gut beschriebene Form der IL-6 Signalkaskade repräsentiert, konnte gezeigt werden, dass miR-17/92 Teil eines positiven Feedback-Loops in der Regulation des IL-6-Signalweges ist. Insbesondere konnte ich dabei zeigen, dass miR-18a (ein Mitglied des miR-17/92 clusters) die Expression von PIAS3, einen Repressor des inflammatorischen IL-6-Signalweges, verminderte und somit die hepatische Akut-Phase-Reaktion verstärkte. Diese Daten identifizierten einen zuvor unbekannten auf miRNA-basierenden Mechanismus der IL-6 Signalkaskade und tragen somit dazu bei, die komplexe Regulation der IL-6 Signaltransduktion besser zu verstehen.