Tumor response under treatment with the microtubule stabilizing agent patupilone and ionizing radiation

Abstract

Radiotherapy is one of the most potent treatment modalities among anti-cancer therapies and is used in the treatment of as many as 50% of all cancer patients worldwide. Ionizing radiation (IR) is often combined with chemotherapeutic agents and/or surgery, leading to further improved tumor growth control. Patupilone (epothilone B) is a clinically relevant microtubule stabilizing agent, which impairs the dynamic instability of the microtubule network important for cell division, migration and invasion. Furthermore, patupilone has the potential to accumulate cells in the radiosensitive G2/M-phase of the cell cycle and also possesses anti- vascular and anti-angiogenic properties. Our laboratory has previously demonstrated an additive effect of combined IR and patupilone treatment in vitro and even a supra-additive tumor growth delay effect in vivo. In this work, we investigated mechanistic and efficacy-oriented aspects of the combined treatment modality of patupilone in combination with IR on xenografts derived from several genetically defined human tumor cell lines. A specific focus was set on the analysis of the tumor microenvironment, especially treatment-induced tumor hypoxia. The human non-small cell lung carcinoma cell line A549 and its patupilone-resistant counterpart A549.EpoB40 were used to investigate the role of patupilone in the radiosensitization of both the tumor cell compartment and the tumor microenvironment. A549.EpoB40 cells harbor a genetically defined mutation in tubulin, which impairs the binding of patupilone leading to patupilone resistance. Combined IR and patupilone treatment of the two different cell lines in vitro and in vivo showed an additive anti-proliferative effect for sensitive A549 cells but not for their resistant counterparts. Analysis of microvessel density and the hypoxic marker pimonidazole revealed a decrease in microvessel density and a consequent increase in pimonidazole-positive areas after patupilone treatment in the A549- derived xenografts, while no difference was observed in the xenografts derived from the resistant cell line. These results indicated a tumor cell-mediated effect on tumor hypoxia in response to microtubule interference by patupilone. Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) is the major transcription factor specifically activated under hypoxia. HIF-1 is responsible for the transcription of various pro-angiogenic cytokines, such as VEGF, which is the most prominent HIF-1 target gene regulating endothelial cell growth and protection. We therefore analyzed the effect of patupilone and IR on the HIF-1alpha protein level and its activity. HIF-1alpha protein and activity levels both decreased in the A549 cell line but not in the resistant A549.EpoB40 cell line in response to patupilone treatment. VEGF expression and secretion were analyzed in vitro under the different treatment conditions. Patupilone treatment of the A549 cell line resulted in decreased levels of both VEGF mRNA and secreted protein. No difference was observed under treatment with patupilone or irradiation in the resistant A549.EpoB40 cell line. An increase in tumor hypoxia was observed in the patupilone-sensitive tumor xenografts after treatment with patupilone alone or when combined with IR. This increase in tumor hypoxia is most likely mediated by the decrease in secreted VEGF from patupilone-sensitive tumor cells, leading to a more fragile or damaged tumor microvasculature. Hypoxic tumors are 2-3 times more radiation resistant than normoxic tumors. Furthermore, hypoxia increases the aggressiveness and also chemoresistance of tumors. Therefore, we were interested in monitoring the development of tumor hypoxia under treatment over a prolonged time period in the A549-derived xenografts. For this purpose we developed a luciferase-based reporter system, in which part of the oxygen-dependent degradation domain of HIF-1alpha was fused to the luciferase reporter gene. In this hypoxia reporter system, the luciferase gene is stabilized under hypoxia and degraded under normoxia independently of the transcriptional activity of HIF-1. Tumor xenografts derived from A549 cells, stably expressing this luciferase construct, revealed a prolonged, transient increase in luciferase activity after patupilone treatment in comparison to untreated control tumor xenografts. Interestingly, luciferase activity did not increase in tumor xenografts of mice that did not respond to patupilone treatment at the level of tumor growth. These results suggest that an increase in tumor hypoxia might be used as a surrogate marker for the antitumoral treatment response to patupilone. Irradiation in combination with patupilone was investigated as part of both concomitant and adjuvant treatment modalities in A549 xenografts. Importantly, despite patupilone-induced hypoxia, the potency of IR was not reduced in either treatment scheme.
As part of our efficacy-oriented studies, we investigated the combined treatment of patupilone and IR on medulloblastoma cell lines in vitro and in vivo. Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in children with poor prognosis and is typically treated with surgery followed by IR and adjuvant chemotherapy. Patients suffer severe side effects after therapy with the microtubule destabilizing agent vincristine, a part of many chemotherapy regimens. Analysis of the effect of the microtubule stabilizing agent patupilone on medulloblastoma cell lines in vitro revealed cellular accumulation in the radiosensitive G2/M phase of the cell cycle, a decrease in proliferation and an induction of apoptosis or autophagy. The combined treatment with IR led to a reduction in clonogenicity in an at least additive manner. Interestingly, combined treatment of medulloblastoma-derived xenografts revealed a strong supra-additive tumor growth control with complete tumor regression in vivo. These results indicate that patupilone might be a promising replacement for vincristine as part of a combined treatment strategy with IR.
This study demonstrates that the combined treatment modality of patupilone and IR is an effective and attractive strategy for anti-cancer treatment. The sensitizing effect of patupilone for IR treatment acts at multiple layers: patupilone has the potential to accumulate cells in the most radiosensitive phase of the cell cycle and to sensitize endothelial cells to IR by the inhibition of paracrine signals provided by tumor cells. Furthermore, patupilone exhibits anti- proliferative activity under normoxic and hypoxic conditions, and patupilone-induced tumor hypoxia does not hamper the radiation response of tumor xenografts, as demonstrated at the level of tumor growth delay. These results demonstrate that the combined treatment of patupilone and IR might be of great benefit for cancer therapy but still needs to be evaluated in clinical trials.

Die Radiotherapie ist eine der potentesten Krebstherapieformen, die bei der Behandlung von 50% aller Krebspatienten eingesetzt wird. Die ionisierende Bestrahlung wird oft mit Chemotherapie und/oder Chirurgie kombiniert, um schlussendlich zu einer besseren Tumorkontrolle zu führen. Patupilone ist ein klinisch relevanter Wirkstoff, der zu einer Stabilisierung der Mikrotubuli führt. Patupilone beeinträchtigt somit die dynamische Instabilität des Mikrotubulinetzwerkes, die wichtig für die Zellteilung, Migration und Invasion ist. Des Weiteren führt Patupilone zu einer Ansammlung der Zellen in der radiosensitiven G2/M-Phase des Zellzyklus und zu einer negativen Beeinflussung der Tumorvaskulatur. Studien unseres Labors zeigten einen additiven Effekt der kombinierten Therapie von Patupilone und ionisierender Bestrahlung auf die Hemmung des Tumorzellwachstum in vitro und eine noch stärkere Hemmung des Tumorwachstums in vivo.
In dieser Arbeit wurden verschiedene mechanistische und auf Effizienz ausgerichtete Aspekte der kombinierten Therapie von Patupilone und Bestrahlung, in verschiedenen Tumormodellen definierter humaner Tumorzelllinien untersucht. Ein besonderer Fokus lag dabei auf der Untersuchung der Tumorumgebung. Insbesondere wurde der durch Behandlung induzierte Sauerstoffmangel (Hypoxie) innerhalb des Tumors analysiert. Die humane Lungenkrebszelllinie A549, sowie ihr Patupilone resistentes Pendant A549.EpoB40, wurden für die Untersuchung der Rolle von Patupilone in der Sensibilisierung für die Bestrahlung, auf der Ebene der Tumorzellen und der Tumorumgebung verwendet. Die A549.EpoB40 Zelllinie besitzt eine genetisch definierte Mutation innerhalb des -Tubulin, welche die Bindung von Patupilone verhindert und somit zu einer Resistenz gegen den Wirkstoff führt. Die Behandlung der zwei verschiedenen Zelllinien mit der kombinierten Therapie von Patupilone und Bestrahlung, in vitro und in vivo, zeigten einen additiven Effekt auf die Hemmung des Tumorzellwachstums der sensitiven A549 Zelllinie, nicht aber für ihr resistentes Pendant. Untersuchungen der Dichte kleinster Blutgefässe, sowie der Bindung des Hypoxie Markers Pimonidazole, ergaben eine Verringerung der Blutgefässdichte mit gleichzeitiger Zunahme der Bindung von Pimonidazole nach Behandlung mit Patupilone in den Tumoren der A549 Tumorzelllinie, nicht aber in Tumoren der resistenten Zelllinie. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die Tumorhypoxie als Antwort auf die Beeinträchtigung der Mikrotubulifunktion der Tumorzellen durch die Behandlung mit Patupilone beeinflusst wird. Der Hypoxie-induzierte Faktor 1 (HIF-1) ist der wichtigste Transkriptionsfaktor der unter Hypoxie aktiviert wird. HIF-1 ist für die Transkription verschiedener Angiogenese fördernde Zytokine, wie dem vascular endothelial growth factor (VEGF) verantwortlich. VEGF ist das wichtigste Zielgen von HIF-1, das das Wachstum und den Schutz von Endothelzellen reguliert. Aus diesem Grund wurde der Effekt von Patupilone und Bestrahlung auf die HIF- 1alpha Proteinmenge, der sauerstoffsensitiven Untereinheit von HIF-1, und die HIF-1 Aktivität untersucht. Die Proteinmenge von HIF-1alpha sowie die HIF-1 Aktivität, verringerten sich in der A549 Zelllinie als Antwort auf die Behandlung mit Patupilone, nicht aber in den resistenten A549.EpoB40 Zellen. Die VEGF Expression und Sekretion wurde in vitro unter den verschiedenen Therapieformen analysiert. Die Behandlung mit Patupilone in der sensitiven Zelllinie führte zu einer Abnahme von VEGF mRNA, sowie in der Menge des sekretierten Proteins. Stattdessen konnte in den resistenten A549.EpoB40 Zellen nach Behandlung mit Patupilone oder Bestrahlung kein Unterschied bezüglich der VEGF mRNA und Proteinmenge festgestellt werden. Tumorxenografts der Patupilone sensitiven Zelllinie zeigten einen Anstieg in der Tumorhypoxie nach Behandlung mit Patupilone, oder Patupilone in Kombination mit Bestrahlung. Dieser Anstieg der Tumorhypoxie wird vermutlich durch die Abnahme an sekretiertem VEGF der Patupilone sensitiven Zelllinie verursacht, der zu einer schwachen oder geschädigten Tumorvaskulatur führt. Hypoxische Tumore sind 2-3mal strahlenresistenter als normoxische Tumore. Des Weiteren führt Hypoxie zu einer verstärkten Aggressivität und Chemoresistenz von Tumoren. Aus diesem Grund waren wir daran interessiert, die Entwicklung der Tumorhypoxie, während der Behandlung mit verschiedenen Therapieformen, über eine verlängerte Zeitspanne in A549-Xenografts zu verfolgen. Wir entwickelten ein, auf das Enzym Luciferase basierendes, Reporter System. In diesem System wurde ein Teil der sauerstoffabhängigen Domäne von HIF-1alpha, die für den Abbau des Proteins unter Normoxie verantwortlich ist, an das Luciferase Gen kloniert. Hypoxie führt in diesem Reporter System zu einer Stabilisierung des Luciferase Proteins, unabhängig von der HIF-1 Aktivität, und zu einem Abbau unter Normoxie. Tumorxenografts der A549 Zelllinie, die das Luciferase Konstrukt stabil exprimierten, zeigten einen verlängerten transienten Anstieg der Luciferase Aktivität nach Behandlung mit Patupilone im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltumoren. Interessanterweise stieg die Luciferase Aktivität in Mäusen, die hinsichtlich des Tumorvolumens nicht auf die Behandlung mit Patupilone ansprachen, nicht an. Diese Resultate deuten darauf hin, dass eine Zunahme in der Tumorhypoxie als Surrogat für das Tumoransprechen auf die Behandlung mit Patupilone verwendet werden könnte. Die Bestrahlung in Kombination mit Patupilone wurde als Teil einer adjuvanten und konkomitierenden Behandlungsmethode in A549 Xenografts untersucht. Trotz einer durch Patupilone induzierten Hypoxie wurde die Wirksamkeit der ionisierenden Bestrahlung weder in der konkomitierenden noch in der adjuvanten Behandlungsmethode reduziert. Als Teil unserer Effizienz orientierten Studie wurde der Einfluss der kombinierten Behandlung mit Bestrahlung und Patupilone auf Medulloblastoma Zelllinien in vitro und in vivo untersucht. Medulloblastoma ist der häufigste bösartige Gehirntumor mit schlechter Prognose und massiven Nebenwirkungen nach der Therapie, zum Beispiel nach dem Mikrotubuli destabilisieren Wirkstoff Vincristine, in Kindern. Untersuchungen von dem Mikrotubuli stabilisierenden Wirkstoff Patupilone auf Medulloblastoma Zelllinien zeigten eine Anhäufung der Zellen in der radiosensitiven G2/M Phase des Zellzyklus, eine Verringerung der Proliferation sowie eine Induktion von Apoptose oder Autophagie. Die kombinierte Behandlung mit Bestrahlung führte zu einer mindestens additiven Verringerung der Klonogenität der Zellen. Interessanterweise führte die kombinierte Behandlung von Xenografts einer Medulloblastoma Zelllinie zu einer sehr starken Tumorkontrolle mit teilweise kompletter Tumorremission. Diese Resultate weisen darauf hin, dass Patupilone eine vielversprechende Alternative zu Vincristine in der kombinierten Therapieform mit Bestrahlung sein könnte. Diese Studie zeigt, dass die kombinierte Behandlungsmethode von Patupilone und Bestrahlung eine effektive und attraktive Strategie in der Krebsbehandlung ist. Zusammenfassend wirkt der strahlensensibilisierende Effekt von Patupilone auf verschiedenen Ebenen. Patupilone hat einerseits das Potential Zellen in der radiosensitiven Phase des Zellzyklus anzuhäufen, andererseits sensibilisiert Patupilone die Endothelzellen, durch eine Inhibierung parakriner Signale der Tumorzellen, auch für die Bestrahlung. Des Weiteren kann Patupilone seine wachstumsinhibierende Wirkung sowohl unter Hypoxie als auch unter Normoxie entfalten. Ausserdem wird die Strahlenwirksamkeit in einer kombinierten Therapie nicht von der Patupilone induzierten Hypoxie beeinflusst, wie auf der Ebene der Tumorwachstumshemmung gezeigt werden konnte. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die kombinierte Behandlung von Patupilone und Bestrahlung einen grossen Nutzen für die Krebstherapie haben könnte, nachdem sie in klinischen Studien validiert worden ist.