Oxygen-dependent regulation of base excision repair and its role in oxidative stress tolerance and tumor therapy resistance

Abstract

Adaptation to a world with 20% oxygen in its atmosphere is closely linked to the ability of organisms to couple with oxygen's harmful potential. DNA damage by reactive oxygen species (ROS) is a major issue, since insufficient elimination of damaged bases (lesions) from DNA is deleterious and leads to cancer. Repair of DNA lesions including the most mutagenic 8-oxo-guanine (8-oxo-G) relies on base excision repair (BER) - a complex orchestra of 30 different proteins-, which are required to be subtly regulated in order to keep DNA repair activate only when necessary, thus preventing genomic instability. In the past years mechanisms regulating BER dependent on the cell cycle or in response to severe DNA damage rapidly induced by oxidizing agents and irradiation have been uncovered. However, how BER is regulated when DNA is continuously damaged through extensive exposure to ROS, generated by excessive oxygen consumption (like observed during tissue growth and regeneration), or contrary, in deprivation of oxygen (like tumor hypoxia), has not been clearly defined so far. Moreover, mechanisms controlling BER in these responses and their role in cell physiology and/or tumorigenesis have not been elucidated. In this thesis work, the expression of four core BER genes – the two DNA glycosylases hOGG1 and MUTYH and the two DNA polymerases λ and β – was activated by hypoxia, and, in spite of gradual decline, was maintained, during the entire period of re-oxygenation, thus resulting in increased capacity of hOGG1 initiated BER, both under hypoxia and upon reoxygenation. The capacity of hOGG1 mediated BER was controlled via the HIF-1α pathway, that under hypoxia-induced both mRNA and protein levels of hOGG1 and DNA polymerase β. However, during reoxygenation, the activity of the hOGG1 protein was also influenced by protein kinase B (PKB, Akt) dependent phosphorylation. Phosphorylation of the hOGG1 on Ser51 by Akt2 increased activity of hOGG1 mediated BER upon re-oxygenation, due to accelerated nuclear translocation. Simultaneously, the capacity of MUTYH initiated BER was increased under hypoxia, as a result of elevated expression of DNA polymerase λ, which was caused by the mTOR kinase. Although, increased BER capacity of hypoxic cells was not promoting their survival or tolerance to DNA damage, re-oxygenated cells were extremely resistant to various types of DNA damage. This suggested that hypoxic preconditioning is a main way to alter BER capacity under changing oxygen availability and consumption. Furthermore, the expression of the four core BER genes, and BER function was uncoupled from the amount of ROS generated or from the content of oxidative lesions in DNA, either during hypoxia, re-oxygenation, or their transitions. Finally, the expression of BER genes and the capacity of BER were elevated in solid tumors of human and animals. Like observed in case of non-transformed cells, upon re-oxygenation, it allowed revived tumor cells to tolerate excessive DNA damage caused by multiple, also therapeutic, agents, and thus determined their ex vivo resistance to anti-cancer treatment.


Die Anpassung an eine Welt mit ihren 20% atmosphärischen Sauerstoff ist eng mit der Fähigkeit eines Organismus verknüpft, auch mit seinem schädlichen Potential umzugehen. Die Reparatur der DNA Schäden, die durch sogenannte “Reactive Oxygen Species“ (ROS) entstehen, ist sehr wichtig, da eine ungenügende DNA Reparatur zu Krebs führen kann. Die DNA Reparatur, welche die sogenannten 8-oxo-guanine (8-oxo-G) entfernen kann, bezeichnet man als Basenexzisionsreparatur (BER). Diese umfasst 30 verschiedene Proteine, welche zu korrekten Reparatur, sowie zur Verhinderung der genetischen Instabilität beitragen. In den letzten Jahren wurden regulatorische Mechanismen entdeckt, die auf eine Abhängigkeit der BER vom Zellzyklus und der Checkpointkontrolle hindeuten. Hingegen ist nicht bekannt, wie die BER auf hohe Mengen ROS reagiert, wie sie bei erhöhtem Sauerstoffverbrauch der Zelle entstehen (z. Bsp. beim Gewebewachstum und bei der Geweberegeneration). In Gegensatz dazu ist ebenfalls bei der sogenannten Sauerstoffunterversorgung wenig bekannt (z. Bsp. Hypoxie bei Tumoren). Dabei weiß man vor allem noch sehr wenig über deren Regulationsmechanismen.In dieser Dissertationsarbeit wurden vier wichtige BER Proteine untersucht. Es handelt sich um die beiden DNA Glykosylasen hOGG1 und MUTYH und die beiden DNA Polymerasen λ und β. Sie wurden in Bezug auf Hypoxie mit anschließender Reoxygenierung getestet. Die hOGG1 initiierte BER wurde sowohl unter Hypoxie als auch während der Reoxygenierung massiv stimuliert. Die Kontrolle erfolgte durch den HIF1a Regulationsweg, indem sowohl die mRNA als auch die Proteine Mengen von hOGG1 als auch von DNA Polymerase β induziert wurden. Im Weiteren wurde während der Reoxygenierung die Aktivität von hOGG1 durch Phosphorylierung durch die Proteinkinase B (PKB, Akt) beeinflusst. Phosphorylierung von hOOG1 am Ser51 by Akt2 erhöhte die Aktivität von hOGG1 vermittelter BER während der Reoxygenierung, indem hOGG1 rascher in den Zellkern transportiert wurde. Auf der anderen Site wurde die Aktivität von MUTYH iniziierter BER unter Hypoxie stimuliert. Dies weil die Expression von DNA Polymerase λ als Folge der mTOR Kinase erhöht war. Überraschenderweise waren reoxygenierte Zellen sehr resistent gegen DNA Schäden. Dies deutete darauf hin, dass die Zellen konditioniert sind auf häufigen Wechsel in ihrer Sauerstoffumgebung. Im Weiteren waren die vier erwähnten BER Proteine unabhängig vom der Menge produzierten ROS oder von der Menge der effektiven Sauerstoffschäden, die während der Hypoxie und der Reoxygenierung entstanden. Schließlich wurden in Tumoren von Mensch und Hund erhöhte BER Werte gefunden. Dies deutet darauf hin, dass Tumorzellen nach Reoxygenierung höhere DNA Schäden überleben können und somit eine Resistenz gegen Chemotherapeutika entwickeln können.