Abstract
The kidney regulates the body’s fluid volume, mineral composition and acidity by excretion and reabsorption of electrolytes and water. The ability of the kidney to regulate salt homeostasis and extracellular fluid volume is crucial for blood pressure maintenance. The mineralocorticoid hormone aldosterone adjusts salt homeostasis largely by regulating sodium reabsorption across principal cells of the aldosterone-sensitive distal nephron (ASDN). The stimulatory action of aldosterone on sodium reabsorption in the distal nephron has been shown to depend mainly on transcriptional regulation that is mediated by the activation of the mineralocorticoid receptor, a member of the family of nuclear receptors. Early genomic effects on sodium reabsorption are thought to be mediated mostly by the induction or repression of elements of the regulatory pathways that control the function of preexisting epithelial sodium channel (ENaC), sodium potassium pump (Na+-K+-ATPase) and potassium channel (ROMK). Aldosterone regulates the cell-surface expression and function and subsequent internalization of ENaC in its target cells partly by the transcriptional induction of the serum- and glucocorticoid-regulated kinase 1 (Sgk1). This kinase prevents the ubiquitylation of ENaC by phosphorylating the ubiquitin ligase Nedd4-2. The aim of my project was to investigate the mechanism by which the early aldosterone-induced changes in gene expression impact on sodium and potassium transport in aldosterone target cells in the kidney. A microarray of RNA extracted from mouse epithelial cells of the ASDN had identified 22 significantly and more than two-fold early aldosterone-regulated RNA in vivo. The focus of this work was on three of these significantly up-regulated gene products: the ubiquitin-specific proteases Usp2 and Usp53 and the voltage gated proton channel Hv1. In exogenous gene expression systems like Xenopus laevis oocytes and cultured mouse cortical collecting duct cells their impact on channels and transporters involved in the sodium absorption in the collecting duct was investigated using electrophysiological techniques. A pronounced induction of ENaC mediated currents by the co-expression of the Usp2 isoform Usp2-45 was detected using two-electrode voltage-clamp recordings. The stimulatory effect on ENaC was not additive to that of Sgk1. This suggests that Usp2-45 acts on the same regulatory pathway as Sgk1, namely the ubiquitylation/deubiquitylation of ENaC. The stimulation of ENaC is further due to the catalytic action of Usp2-45 since substitution of Cys67 with Ala within the catalytic site of Usp2-45 abolished its effect. Further experiments performed in cultured human embryonic kidney cells showed that indeed Usp2-45 deubiquitylates and thereby activates ENaC. Another ubiquitin-specific protease, Usp53 was significantly up-regulated in the mouse distal nephron. Experiments aiming at investigating the possible impact of Usp53 on sodium transport molecules (ENaC, Na+-K+-ATPase) expressed in Xenopus laevis oocytes were inconclusive and the role of Usp53 in regulating salt reabsorption remains elusive. The third investigated gene product, a voltage gated proton channel (Hv1) structurally resembles the voltage sensor of typical voltage gated channels of the S4-family. Hv1 substantially decreases ENaC and ROMK function in oocytes which appears contradictory to the fact that it is up-regulated by aldosterone. However, early up-regulation of a voltage gated proton channel in the ASDN could be essential in the regulatory control of salt reabsorption fine tuning by aldosterone.
Die Nieren sind für die Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsvolumens, der Salzzusammensetzung und des Säure-Base-Haushaltes des Körpers zuständig. Dies geschieht durch Ausscheidung und Reabsorption von Elektrolyten und Wasser. Die Regulierung des Salzhaushaltes und des Volumens der extrazellulären Flüssigkeit ist für die Aufrechterhaltung des Blutdrucks essentiell. Das Mineralokortikoidhormon Aldosteron regelt den Salzhaushalt vor allem durch die Stimulation der Natriumrückresorption durch die Hauptzellen des Aldosteron sensitiven distalen Nephrons (ASDN). Die Wirkung von Aldosteron auf die Rückresorption von Natrium im distalen Nephron hängt vor allem von der Regulierung der Transkription ab. Diese Aufgabe übernimmt der Mineralokortikoidrezeptor, der zur Familie der nukleären Rezeptoren gehört und durch Aldosteron aktiviert wird. Rasche Änderungen der Transkription wirken sich innerhalb kurzer Zeit auf die Natriumrückresorption aus. Dies wird grösstenteils durch die transkriptionelle Aktivierung und Repression von regulatorischen Faktoren erreicht, die die Funktion von bereits vorhandenen Natriumkanälen (ENaC), Natriumpumpen (Na+- K+-ATPase) und Kaliumkanälen (ROMK) regulieren. Es ist bekannt, dass die Oberflächenexpression und die Funktion von ENaC teilweise durch die transkriptionelle Aktivierung von Sgk1 gesteigert werden. Sgk1 ist eine Kinase, welche die Ubiquitylierung von ENaC verhindert, indem sie die Ubiquitin Ligase Nedd4-2 phosphoryliert und so deren Funktion inhibiert. Das Ziel meines Projektes war es, Mechanismen zu untersuchen, durch welche frühe Aldosteron-induzierte Veränderungen der Genexpression zur Regulation von Natrium und Kalium Transport in Aldosteron Zielzellen führen. Mit Hilfe eines RNA-Microarrays konnten 22 mRNAs identifiziert werden, die in Epithelialzellen des ASDN durch Aldosteron mehr als zweifach hochreguliert sind. Im Fokus dieser Arbeit lagen drei dieser Genprodukte: Die Ubiquitinproteasen Usp2 und Usp53 und ein spannungsabhängiger Protonenkanal (Hv1). Ihr Einfluss auf Kanäle und Transporter, die bei der Natriumrückresorption wichtig sind, wurde vor allem anhand von elektrophysiologischen Methoden an Expressionsystemen wie Xenopus laevis Oozyten und kultivierten Sammelrohrzellen aus der Maus untersucht. Elektrophysiologische Messungen an koexprimierenden X. laevis Oozyten zeigten, dass die Funktion von ENaC durch eine Isoform von Usp2 (Usp2-45) signifikant verstärkt wird. Dieser stimulierende Effekt von Usp2-45 auf ENaC ist nicht additiv zu dem bereits beschriebenen Effekt von Sgk1. Das bedeutet, dass Usp2-45 in dem Selben Regulationsmechanismus eingebunden ist wie Sgk1, nämlich Ubiquitylierung / Deubiquitylierung. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Stimulierung von ENaC auf die katalytische Aktivität von Usp2-45 zurückzuführen ist, da durch die Cys67Ala Substitution im katalytischen Zentrum der stimulatorische Effekt von Usp2-45 ausblieb. Weitere Experimente mit kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen wiesen darauf hin, dass Usp2-45 ENaC in der Tat deubiquityliert und dadurch aktiviert. Im distalen Nephron der Maus ist die mRNA Expression von Usp53, einer weiteren Ubiquitinprotease, ebenfalls durch Aldosteron signifikant hochreguliert. Experimente zur Erforschung ihres möglichen Einflusses auf Natriumtransportmoleküle wurden in X. laevis Oozyten durchgeführt. Die Ergebnisse waren jedoch kontrovers und es bleibt unklar, welche Rolle Usp53 bei der Regulation der Salzrückresorption spielt. Ferner wurde ein Genprodukt untersucht, welches einen spannungsabhängigen Protonenkanal (Hv1) kodiert. Dieser weist eine strukturelle Ähnlichkeit zu dem Sensordomäne von typischen spannungsabhängigen Ionenkanälen der S4 Familie auf. Werden die beiden Ionenkanäle ENaC und ROMK zusammen mit Hv1 exprimiert, verringert sich deren Funktion signifikant. Dieser Effekt steht im Widerspruch zur Aktivierung von Hv1 durch Aldosteron. Die frühe Regulation eines spannungsabhängigen Protonenkanals im ASDN könnte allerdings für die Feinabstimmung der Salzrückresorption durch Aldosteron bedeutungsvoll sein.
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Adam, Gabriele